一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗及制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗及制备方法及其应用，通过基因工程技术在体外大量表达鸡载脂蛋白apo VLDL ‑ II重组蛋白，将纯化的apo VLDL ‑ II 抗原与适宜佐剂制备成疫苗；将制备的疫苗免疫产蛋鸡，显著地降低了鸡蛋中胆固醇的含量。本发明专利技术建立的方法，是一种新的安全、成本低且高效的降低产蛋鸡鸡蛋胆固醇含量的疫苗制备方法，所制备的apo VLDL ‑ II疫苗可降低鸡蛋中40% ~60%的胆固醇含量。

Vaccine for reducing cholesterol content of egg and preparation method and application thereof

The invention discloses a method for reducing the content of cholesterol in egg vaccine and preparation method and application thereof, through gene engineering technology in the in vitro expression of chicken apolipoprotein apo VLDL II recombinant protein, purified apo VLDL II antigen prepared with suitable adjuvant vaccine; preparation the vaccinated hens significantly decreased the content of cholesterol in egg. The method of the invention, the vaccine is a new preparation method of safety, low cost and high efficiency of the low layer egg cholesterol content, prepared by apo VLDL II vaccine can reduce the cholesterol content of egg in 40% ~60%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学与基因工程
，涉及一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗及制备方法及应用。
技术介绍
胆固醇(Cholesterol)又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，属于脂类物质。研究表明，食物摄入过多胆固醇是导致人高胆固醇血症或血脂紊乱的主要原因，引起动脉粥样硬化性等心血管疾病，导致心脑血管事件的发生。因此，限制高胆固醇食物摄入对人体健康有着重要的意义。鸡蛋中含有很多有价值的蛋白质、卵磷脂、维生素及矿物质，且各种成份比例平衡合理，是人类最好的营养来源之一，也是人类最常食用的食品之一。同时，鸡蛋也是高胆固醇的食物。每枚鸡蛋中胆固醇含量高达到300mg，其大部分胆固醇主要沉积在蛋黄中，往往超过人体从食物中获取胆固醇的量(健康成年人每天胆固醇的摄入量应低于300毫克)。因此，导致相当部分人群由于忌讳鸡蛋中胆固醇含量高，而放弃食用鸡蛋或弃去鸡蛋蛋黄，造成严重的浪费。根据专利检索及现有文献报道，目前在降低鸡蛋胆固醇方面主要通过如下途径：1.在饲料中添加中药粉末，王维义等在饲料中添加红曲、荷叶提取物、何首乌等成分，具有降低鸡蛋胆固醇的作用，但是效果不显著，制作过程复杂，部分中药材价格昂贵，因此很难得到推广。石传林等在蛋鸡饲养饲料的基础上加入了茯苓、泽泻等名贵中药材的同时加入了商业袋装粉状益生素，主要含乳酸菌、双歧杆菌等菌株，能降低鸡蛋中胆固醇30％左右。但是，此方法存在操作复杂，价格昂贵等问题，且目前并未见在生产中得到应用。2.在饲料中添加其他成分，例如莫纳可林K红曲、洛伐他丁等，但是效果并不明显。相比于这些传统的降鸡蛋胆固醇方法，本专利采用免疫的方法，能有效的降低了鸡蛋中胆固醇的含量40％以上，且本方法操作简单，见效快，安全可靠，并可大规模应用于实际生产。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术针对现有技术中存在的不足和缺陷，提供一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗制备方法及应用，安全、成本低、高效，而不影响鸡蛋的品质。解决以上技术问题的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗，其特征在于：所述疫苗是由apo VLDL–II重组蛋白和免疫佐剂组成，所述apo VLDL–II重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述apo VLDL–II重组蛋白与免疫佐剂按照体积比为1：1进行乳化而成,总体系为200～1000μl，其中apo VLDL–II重组蛋白中蛋白量为100～1000ug。所述的免疫佐剂为弗氏佐剂、蜂胶佐剂或铝佐剂。所述apo VLDL–II重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本专利技术中的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗制备方法，包括以下步骤：(1)引物设计：使用Primer 5.0软件设计apo VLDL–II基因表达的引物；(2)RNA的抽提与转录：从母鸡肝脏中提取RNA，经逆转录合成cDNA；(3)荧光定量realtime PCR扩增反应：以cDNA为模板通过PCR扩增获得apo VLDL-II全长；apo VLDL-II基因的获取：从母鸡去取出的新鲜肝脏中提取RNA，经逆转录合成cDNA。以cDNA为模板通过PCR技术获得apo VLDL-II全长及apo B部分基因，apo VLDL-II全长共321个核苷酸，编码氨基酸106个。分析apo B的主要功能区域，选择apo B C端部分基因，共519个核苷酸，编码氨基酸173个。(4)免疫原的制备：分别构建pET32a-apo VLDL-II与pET32a-apo B重组质粒，转化BL21功能菌，表达出apo VLDL-II及apo B重组蛋白，apo VLDL-II重组蛋白分子量大小为27kDa，apo B重组蛋白分子量为35kDa；(5)疫苗的制备与免疫产蛋鸡：将纯化的apo VLDL-II及apo B重组抗原分别加入完全弗氏佐剂经乳化后即成。本专利技术中所述扩增基因apo VLDL-II所述PCR扩增引物为：上游引物：5’-CCGGAATTC EcoR I ATGGTGCAATACAGGGCAT-3’；下游引物：5’-CCGCTCGAG Xho I CTAGTAGCCTAGCACTTTT-3’，PCR退火温度为52℃。步骤(4)中apo VLDL-II免疫原的制备具体为：从母鸡去取出的新鲜肝脏中提取RNA，经逆转录合成cDNA。以cDNA为模板通过PCR技术获得apo VLDL-II全长基因，通过基因工程技术，将该片段克隆到pET32a原核表达载体上，转化基因工程菌E.coli BL21(DE3)，完成了apo VLDL-II重组蛋白的原核诱导表达，该蛋白以可溶性形式表达，最终纯化出了apo VLDL-II重组蛋白。PCR扩增的产物，经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切回收后，与同样经过双酶切处理的pET32a原核表达载体进行连接和转化，形成重组质粒pET32a-apo VLDL-II；将重组质粒pET32a-apo VLDL-II转化E.coli BL21(DE3)，次日挑取单菌落接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃，200rpm振荡培养；过夜至8h后，按1﹕1000接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导，温度为26℃-37℃；诱导过夜后，8000rpm离心10min收集菌体，灭菌水洗涤菌体一次，加入终浓度为0.25mg/ml的溶菌酶，冰浴1h，采用超声法裂解菌体，10000rpm离心10min，收集沉淀和上清，SDS–PAGE电泳检测确定apo VLDL-II重组蛋白以可溶形式表达后，使用Ni-NTA树脂纯化apo VLDL-II重组蛋白。所述LB液体培养基为按照质量体积比，由胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％组成。步骤(5)中免疫产蛋鸡的方法为将纯化的apo VLDL-II与弗氏佐剂按V:V＝1:1混合乳化3-5h，2-3点对产蛋鸡进行肌肉注射；第一免疫后每2周加强免疫一次，共2次。免疫前一周开始收集鸡蛋，称量鸡蛋与蛋黄质量，并检测蛋黄中总胆固醇的含量。本专利技术中的应用即免疫产蛋鸡是通过肌肉或皮下多点注射免疫产蛋鸡，初免剂量为500ug/只；每隔一周加强免疫一次，共两次，免疫剂量调整为300ug/只，免疫前一周开始采集鸡血，一周一次，采集到的血液于4℃静置过夜，5000rpm离心10min，取血清分别检测apo VLDL-II特异性的抗体滴度。apo VLDL-II是禽鸡胆固醇运输到蛋黄过程中非常关键的转运受体，与人血脂有本质的区别。我们前期研究显示阻断apo VLDL-II，可以显著降低鸡蛋中胆固醇的含量。根据现代分子免疫学理论，采用基因工程技术实现在体外大量表达鸡源apo VLDL-II，将纯化的apo VLDL-II重组蛋白与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，提取鸡蛋蛋黄中总胆固醇并检测含量。本专利技术中免疫产蛋鸡，每2周加强免疫一次，共二次。加强免疫疫苗为纯化的apo VLDL-II重组抗原与不完全弗氏佐剂乳化产物。自免疫前一周开始，间隔两天收集一次鸡蛋；鸡蛋蛋黄中胆固醇的检测：无水乙醇提取蛋黄中的总胆固醇，采用酶法检测胆固醇的含量。附图说明图1为本专利技术中apo VLDLⅡ的PCR扩增结果图图2为本专利技术中SDS-PAGE检测ap本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗，其特征在于：所述疫苗是由apo VLDL – II重组蛋白和免疫佐剂组成，所述apo VLDL – II重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗，其特征在于：所述疫苗是由apo VLDL – II重组蛋白和免疫佐剂组成，所述apo VLDL – II重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗，其特征在于：所述apo VLDL – II重组蛋白与免疫佐剂按照体积比为1：1进行乳化而成, apo VLDL – II重组蛋白中蛋白量为100～1000ug。3.根据权利要求1或2所述的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗，其特征在于：所述免疫佐剂为弗氏佐剂、蜂胶佐剂或铝佐剂。4.根据权利要求1所述的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗，其特征在于：所述apo VLDL – II重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。5.根据权利要求1所述的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1） 引物设计：设计apo VLDL – II基因表达的引物；（2）RNA的抽提与转录：从母鸡肝脏中提取RNA，经逆转录合成cDNA；（3）荧光定量realtime PCR扩增反应：以cDNA为模板通过PCR扩增获得apo VLDL - II 全长；（4）免疫原的制备：构建pET32a - apo VLDL - II重组质粒，转化BL21功能菌，表达出apo VLDL - II 重组蛋白；（5）疫苗的制备：将纯化的apo VLDL - II重组抗原分别加入完全弗氏佐剂混合，即成。6. 根据权利要求5所述的一种降低鸡蛋胆固醇含量的疫苗制备方法，其特征在于：扩增基因apo VLDL - II所述PCR扩增引物为：上游引物：5’ - CCG GAATTC EcoR I ATGGTGCAATACAGGGCAT - 3’；下游引物：5’ - CCG CTCGAG Xho I CTAGTAGCCTAGCACTTTT - 3’，扩增基因apo VLDL - II的PCR体系为15 μL的2×Taq酶体系，其中灭菌超纯水为8 μL，2×Taq酶5 μL，模板cDNA 1 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL；PCR条件具体为：95 °C预变性3 min，进入循环，95 °C变性1 min；55 °C退火35 s；72 °C延伸30 s，共35个...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智，曾波，李再新，
申请(专利权)人：四川理工学院，
类型：发明
国别省市：四川;51