本发明专利技术公开了不同氨基酸结构的重组人内皮抑素蛋白及其制备方法和应用，重组人内皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重组人内皮抑素蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的两种重组蛋白具有抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导下的血管内皮细胞增值活性和抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的活性，而且更容易进入血管内皮细胞和鸡胚绒毛尿囊膜血管内皮细胞内，蛋白穿膜效果和N端的结构稳定性都有显著提高，并且具有直接抑制肿瘤细胞生长的作用，可以发挥更好的抑制新生血管内皮细胞生成的作用，能够用于治疗新生血管生成引起的各种疾病，包括实体肿瘤和糖尿病引起的视网膜病变及类风湿关节炎。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及用基因工程方法制备具有抑制内皮细胞生长活性或抑制肿瘤细胞生长的多种不同氨基酸结构的重组人内皮抑素蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1997年，哈佛大学O’Reilly等发现小鼠血管内皮瘤(EOMA)细胞系的培养液能够抑制血管内皮细胞的增殖。通过分离纯化得到一种新的蛋白质，命名为鼠的Endostatin，后来翻译成血管内皮抑制素(简称内皮抑素)。1997年9月10日，徐根兴等申请了人内皮抑素的专利技术专利(Zl97107112.8),2001年1月10日获得专利技术专利授权，这是内皮抑素国际上最早获得授权的专利之一。通过大肠杆菌表达了人内皮抑素基因，是人胶原蛋白十八基因1503-2055表达的蛋白活性片段，184个氨基酸，分子量20KD。与小鼠内皮抑素氨基酸序列有85.33％的同源性，目前已经完成三期临床研究。美国酵母表达的184个氨基酸的内皮抑素国际上最早进入临床研究，1999年6月，FDA批准EntreMed临床实验申请，I期临床启动，目前停留在II期临床研究中，主要原因在于抗体产生几率高、适应症选择和皮下注射单药用药方式等问题。国际第一个批准生产的内皮抑素类似品种(恩度)是192氨基酸，在内皮抑素的N端增加了MetGlyGlySerHisHisHisHisHis(His)等9个氨基酸，和内皮抑素的183个氨基酸联合形成192个氨基酸的内皮抑素蛋白，大肠杆菌表达。黎晓新等的专利(专利申请号201410102963.2)涉及内皮抑素突变体和聚乙二醇(PEG)修饰的内皮抑素不同氨基酸结构突变的内皮抑素重组蛋白。刘兴汉等的专利(专利申请号200410013621.X)涉及改变内皮抑素氨基酸结构，增强抗肿瘤活性。王风山等的专利(专利申请号201210149201.9)涉及人类免疫缺陷病毒反式激活转导蛋白Tat(TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg)和内皮抑素一起形成的融合蛋白。姚文兵等的专利(专利申请号200810025406.X)涉及含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供多种重组人内皮抑素蛋白，它具有抑制内皮细胞生长的活性，但是氨基酸序列和结构与已经批准专利或批准临床研究的内皮抑素蛋白都不同。本专利技术的第二个目的是提供这两种内皮抑素蛋白的基因工程制备方法，其中分别包括了大肠杆菌原核表达、酵母表达和CHO真核表达三种不同基因工程表达形式。本专利技术的又一目的在于提供上述重组人内皮抑素蛋白的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种重组人内皮抑素蛋白，该重组人内皮抑素蛋白为重组人内皮抑素蛋白1、重组人内皮抑素蛋白2和重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白中的任意一种，所述重组人内皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述重组人内皮抑素蛋白2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。上述重组人内皮抑素蛋白的编码基因，该编码基因具有下述核苷酸序列之一：(1)序列表中SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，其中SEQIDNO.3为编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的重组人内皮抑素蛋白1的核苷酸序列，SEQIDNO.4为编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的重组人内皮抑素蛋白2的核苷酸序列，SEQIDNO.6为编码氨基酸序列如SEQIDNO.5所示的重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的核苷酸序列；(2)编码序列表中如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.5所示氨基酸序列的核苷酸。包含有上述重组人内皮抑素蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。用于表达上述重组人内皮抑素蛋白的重组表达载体，其在于采用以下方法制备：所述重组人内皮抑素蛋白1的重组表达载体pET9c-En1采用以下步骤制备：以SEQIDNO.7所示的内皮抑素核苷酸序列为模板，以如SEQIDNO.8所示的引物(1)和如SEQIDNO.9所示的引物(2)为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物和pET9c载体分别用NdeI和BamHI酶切并进行连接得到重组质粒pET9c-En1；所述重组人内皮抑素蛋白2的重组表达载体pET9c-En2采用以下步骤制备：以上述的重组质粒pET9c-En1为模板，分别以如SEQIDNO.10所示的引物(3)和如SEQIDNO.12所示的引物(5)，以如SEQIDNO.11所示的引物(4)和如SEQIDNO.12所示的引物(5)，以如SEQIDNO.13所示的引物(6)和如SEQIDNO.14所示的引物(7)为引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物1，在以获得的PCR扩增产物1为模板，用如SEQIDNO.10所示的引物(3)和如SEQIDNO.9所示的引物(2)进行PCR扩增获得PCR扩增产物2，将PCR扩增产物2和pET9c载体分别用NdeI和BamHI酶切并进行连接得到重组质粒pET9c-En2；所述重组人内皮抑素蛋白1的重组表达载体pcDNA3.1-En1和所述重组人内皮抑素蛋白2的重组表达载体pcDNA3.1-En2采用以下步骤制备：分别以重组质粒pET9c-En1和重组质粒pET9c-En2为模板，以如SEQIDNO.16所示的引物(9)和如SEQIDNO.17所示的引物(10)为引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物，将PCR扩增产物和pcDNA3.1载体分别用HindIII和XhoI酶切并进行连接分别得到重组质粒pcDNA3.1-En1和重组质粒pcDNA3.1-En2；所述重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的重组表达载体采用以下步骤制备：将如SEQIDNO.6所示的重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白编码基因通过EcoRI和NotI的酶切位点连接到穿梭质粒pPICZαA上得到重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的重组表达载体。本专利技术的各重组人内皮抑素蛋白的制备方法包括如下步骤：所述重组人内皮抑素蛋白1和重组人内皮抑素蛋白2的制备方法为：将如SEQIDNO.3所示的重组人内皮抑素蛋白1的编码基因和如SEQIDNO.4所示的重组人内皮抑素蛋白2的编码基因通过PCR技术分别克隆到pET9c或pCDNA3.1基因载体，分别通过大肠杆菌表达或通过仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，CHO)进行真核细胞可溶性表达，纯化或复性后纯化得到有活性的重组人内皮抑素蛋白1和重组人本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人内皮抑素蛋白，其特征在于：该重组人内皮抑素蛋白为重组人内皮抑素蛋白1、重组人内皮抑素蛋白2和重组人内皮抑素2‑人血清白蛋白融合蛋白中的任意一种，所述重组人内皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组人内皮抑素蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的重组人内皮抑素2‑人血清白蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组人内皮抑素蛋白，其特征在于：该重组人内皮抑素蛋白为重组人内皮抑素
蛋白1、重组人内皮抑素蛋白2和重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白中的任意一种，
所述重组人内皮抑素蛋白1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述重组人内皮抑素蛋白2
的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的重组人内皮抑素2-人血清白蛋白融合蛋白的氨
基酸序列如SEQIDNO.5所示。
2.权利要求1所述重组人内皮抑素蛋白的编码基因，其特征在于：该编码基因具有下
述核苷酸序列之一：
(1)序列表中SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，其中
SEQIDNO.3为编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的重组人内皮抑素蛋白1的核苷酸序
列，SEQIDNO.4为编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的重组人内皮抑素蛋白2的核苷酸
序列，SEQIDNO.6为编码氨基酸序列如SEQIDNO.5所示的重组人内皮抑素2-人血清白蛋
白融合蛋白的核苷酸序列；
(2)编码序列表中如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.5所示氨基酸序列的
核苷酸。
3.包含有权利要求2中所述重组人内皮抑素蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细
胞系和转基因重组菌。
4.用于表达如权利要求1所述重组人内皮抑素蛋白的重组表达载体，其特征在于：
所述重组人内皮抑素蛋白1的重组表达载体pET9c-En1采用以下步骤制备：以SEQID
NO.7所示的内皮抑素核苷酸序列为模板，以如SEQIDNO.8所示的引物(1)和如SEQID
NO.9所示的引物(2)为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物和pET9c载体分别用NdeI
和BamHI酶切并进行连接得到重组质粒pET9c-En1；
所述重组人内皮抑素蛋白2的重组表达载体pET9c-En2采用以下步骤制备：以上述的重
组质粒pET9c-En1为模板，分别以如SEQIDNO.10所示的引物(3)和如SEQIDNO.12所
示的引物(5)，以如SEQIDNO.11所示的引物(4)和如SEQIDNO.12所示的引物
(5)，以如SEQIDNO.13所示的引物(6)和如SEQIDNO.14所示的引物(7)为引物进
行PCR扩增获得PCR扩增产物...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐根兴，
申请(专利权)人：徐根兴，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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