一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物，由ES-2肽分子上的羧基与季铵化壳寡糖分子的氨基通过酰胺键结合，结构式为：(ES-2)n-CO-NH-O-HTCC；式中，n＝1～10；ES-2的分子量为1223Da，等电点为10.42；O-HTCC的分子量为1000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。本发明专利技术还公开了ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物的制备方法。本发明专利技术的ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物与ES-2相比，保留了ES-2分子抗新生血管生成活性和抗肿瘤活性，整合了O-HTCC的良好特性，使其具有稳定性高、半衰期长、细胞亲和性强、靶向性强等的特性；与TMC相比，O-HTCC修饰ES-2的效率更高，因此具有更好的使用效果和应用范围。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用，属于生物医药

技术介绍
内皮抑素(Endostatin，ES)是一种内源性的新生血管生成抑制因子，能够有效地抑制新生血管的形成，从而切断肿瘤的营养供给途径和废物代谢途径，起到抑制肿瘤的生长和转移的作用。ES-2肽(IVRRADRAAVP)是ES结构中一个具有明显抗新生血管生成、抗肿瘤活性的短肽段，更容易进入细胞内部，且更容易获得和改造，但是同ES一样，ES-2肽也存在体内半衰期短和稳定性差等缺点，这些缺点大大的限制了ES-2肽进一步的应用。壳寡糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，结构明确且有靶向性，经季铵化后能进一步提高其带正电荷的能力。N,N,N-三甲基季铵化壳聚糖(TMC)制备过程中，壳寡糖的2-NH2被甲基化后首先生成2-NH(CH3)甚至2-N(CH3)2，然后才能进一步形成2-N(CH3)3+季铵基团，因此，水溶性良好的TMC中的自由氨基数量极少(一般<10％)，导致其对ES-2的结合效率较低、结合物活性保持率差，制约了季铵化壳寡糖对ES-2肽分子进行化学修饰。而且，由于ES-2短肽分子量较小，且等电点位10.42，属于碱性蛋白，所以用同带正电荷的季铵化壳寡糖对其进行修饰的难度相较于对其他非碱性蛋白修饰的难度要大的多。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法。由于在肿瘤发生和发展过程中，新生血管的生成会为肿瘤组织提供营养并运走废物，因此如果抑制肿瘤引起的新生血管的生成，就可以起到“饿死肿瘤”的作用；在糖尿病等疾病过程中，新生血管的生成会导致出血等严重反应，对于新生血管的生成的抑制可以明显治疗病人视网膜病变等并发症。因此，本专利技术的另一个目的是提供该ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物在制备抗新生血管生成和/或抗肿瘤药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物，由ES-2肽分子上的羧基与季铵化壳寡糖(O-HTCC)分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：(ES-2)n-CO-NH-O-HTCC；式中，n＝1～10；ES-2的分子量为1223Da，等电点为10.42；O-HTCC的分子量为1000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。优选的，所述n＝1～5，即一分子O-HTCC与1～5分子ES-2共价结合形成修饰物；O-HTCC的分子量为1000Da～10000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50％。季铵化壳聚糖的分子量会影响所修饰的ES-2肽的活性，若季铵化壳聚糖的分子量过大，会造成严重的空间位阻和构象变化，使小分子的ES-2肽的活性显著降低；但季铵化壳聚糖的分子量也不宜过低，需保证一定量的自由氨基数量。本专利技术综合考虑所修饰的ES-2肽的活性以及与季铵化壳聚糖结合率，优选O-HTCC的分子量为1000Da～10000Da，在较好保持ES-2肽活性的同时，还提高了与季铵化壳聚糖的结合率。除非另外指出，术语―自由氨基”：伯胺基团(即—NH2)，亦称一级胺基。术语“季铵化壳寡糖”：壳寡糖的C6-OH上接枝一个含有季铵盐的基团而得到的衍生物。上述ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物的制备方法，步骤为：(1)向ES-2肽溶液中加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行羧基活化，ES-2肽与EDC的摩尔比为1：(1-100)，EDC与NHS的摩尔比为3：(0.1-5)，反应温度为20℃～30℃，缓慢搅拌且避光反应15～45min；(2)将步骤(1)反应后的溶液加入到季铵化壳聚糖溶液中，使ES-2肽与季铵化壳寡糖的质量比为1：(0.1～30)，反应4～8h，得粗品，经分离纯化，即得ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物。步骤(1)中，所述ES-2肽溶液为将ES-2肽溶于PBS缓冲液而得到的溶液；ES-2肽溶液的pH为4.0-6.0，其中ES-2肽的浓度为0.5～5mg/ml。步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液为将季铵化壳聚糖溶于PBS缓冲液而得到的溶液；季铵化壳聚糖溶液的pH优选为7.0-9.0，其中季铵化壳聚糖的浓度为1～5mg/ml。由于中性偏碱性环境有利于ES-2肽分子的羧基与季铵化壳寡糖分子的氨基的酰胺键的形成，故本专利技术将季铵化壳聚糖溶液的pH选择为7.0-9.0。步骤(2)中，所述分离纯化的具体方法为：采用SephadexG-25或Sephadex30凝胶层析柱进行分离纯化；用pH为6.0，浓度25mmol/L磷酸盐缓冲液进行线性洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm，收集洗脱峰组分；采用截留分子量为500～1000D透析袋中透析48h，去除盐分，冷冻干燥。由于SephadexG-25和Sephadex30凝胶层析柱的分离纯化范围是0～10000，ES-2和季氨化壳寡糖以及修饰物的分子量正好处于这两种凝胶层析柱的分子范围之中，所以本专利技术选择SephadexG-25或Sephadex30作为凝胶层析柱进行分离纯化，其分离纯化效果较好。优选的，步骤(1)中，ES-2肽与EDC的摩尔比为1∶(10～50)，EDC与NHS的摩尔比为3：(0.2～2)。优选的，步骤(2)中，ES-2肽与季铵化壳寡糖的质量比为1：(0.5～5)。优选的，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，加入乙醇，室温搅拌，充分溶胀后加入苯甲醛，制得乳白色胶状反应液；将上述乳白色胶状反应液干燥后研磨，加入异丙醇、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵进行反应，反应液经过滤、洗涤、干燥后，再加入盐酸乙醇溶液进行反应，经沉淀、干燥后得季铵化壳聚糖粗品；上述季铵化壳聚糖粗品溶于水中，采用截留分子量为100～500D透析袋中透析48h，去除小分子杂质，透析液冷冻干燥，制得季铵化壳聚糖(O-HTCC)。本专利技术制备的季铵化壳聚糖，将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)接枝到壳寡糖C6-OH上得到O-(羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳寡糖(O-HTCC)衍生物，水溶性更好，自由氨基率在90％以上。采用EDC-NHS对羧基进行活化，是有机合成反应中的常用方法，但也是难点所在，EDC和NHS的加入量、反应体系的pH、反应温度和反应时间等因素都会影响活化的效率；而且不同条件活化后的羧基与氨基的结合率也存在较大差异。本专利技术针对ES-2肽为碱性蛋白，采用同带正电荷的季铵化壳聚糖对其进行修饰的难度较对其他非碱性蛋白进行修饰难度要大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ES‑2肽的季铵化壳寡糖修饰物，其特征在于，由ES‑2肽分子上的羧基与季铵化壳寡糖分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：(ES‑2)n‑CO‑NH‑O‑HTCC；式中，n＝1～10；ES‑2的分子量为1223Da，等电点为10.42；O‑HTCC的分子量为1000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。

【技术特征摘要】
1.一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物，其特征在于，由ES-2肽分子上的羧基与季铵化
壳寡糖分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：
(ES-2)n-CO-NH-O-HTCC；
式中，n＝1～10；ES-2的分子量为1223Da，等电点为10.42；O-HTCC的分子量为1000Da
以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。
2.如权利要求1所述的ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物，其特征在于，所述n＝1～5；
O-HTCC的分子量为1000Da～1000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50％。
3.权利要求1或2所述的ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物的制备方法，其特征在于，步
骤为：
(1)向ES-2肽溶液中加入EDC和NHS进行羧基活化，ES-2肽与EDC的摩尔比为1：
(1-100)，EDC与NHS的摩尔比为3：(0.1-5)，反应温度为20℃～30℃，缓慢搅拌且避光
反应15～45min；
(2)将步骤(1)反应后的溶液加入到季铵化壳聚糖溶液中，使ES-2肽与季铵化壳寡糖
的质量比为1：(0.1～30)，反应4～8h，得粗品，经分离纯化，即得ES-2肽的季铵化壳寡糖
修饰物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述ES-2肽溶液的pH
为4.0-6.0，其中ES-2肽的浓度为0.5～5mg/ml。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液
的pH为7.0-9.0，其中季铵化壳聚糖的浓度为1～5mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭海宁，王娟，张丛丛，刘纯慧，于洋，孙凤，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37