半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物制造技术

本发明专利技术将目标抗体的轻链205位缬氨酸（V）改造为半胱氨酸（C），并通过此改造后的半胱氨酸的游离巯基（‑SH）与偶联了小分子高活性细胞毒素（Payload）的mc‑vc‑PAB‑OH连接子进行定点偶联，形成均一性优良的半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其毒素比抗体比例（DAR）为1.6‑2.0。此抗体‑毒素偶联物具有通式：2C1‑LC‑V205C‑mc‑vc‑PAB‑payload。同时，本发明专利技术还披露了此TDC药物的制备、纯化方法，对表达EGFRvIII及过表达EGFRwt肿瘤的治疗应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种化合物及其制备方法和用途，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)及其制备方法和用途。
技术介绍
：表皮生长因子受体EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是一种糖蛋白，属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，贯通细胞膜，分子量170KDa，靠与配体结合来激活。激活后，EGFR由单体转化为二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。EGFR通常低量表达于多种正常组织细胞，包括皮肤、肝脏等，与正常生理作用相关。EGFR过表达与多种肿瘤的发生与发展相关，包括头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(Atalayetal.,2003；HerbstandShin,2002)。多种肿瘤在过量表达野生型EGFR(EGFRwt)的同时也表达突变型的EGFR，EGRFvIII(de2-7EGFR)。EGRFvIII是EGFRwt第6-273氨基酸缺失的EGFR突变型(Sugawaetal.,1990)，介导配体非依赖型的细胞持续活化。EGRFvIII被报道于多种肿瘤中，包括脑胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrandetal.,1997；OlapadeOlaopaetal.,2000)。EGRFvIII的出现往往预示肿瘤预后不良。EGRFvIII特异性表达于肿瘤细胞组织中，正常组织细胞不表达EGRFvIII，这为靶向治疗提供了良好的靶点。抗体-毒素偶联物(Antibodydrugconjugate,ADC)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物Adcetris和Kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个ADC药物在进行临床阶段研究。以EGFRvIII为靶点的通过链间二硫键巯基非定点偶联的ADC药物ABT-414已在美国进行临床II期试验，体现出一定的临床效果，但由于其采用非定点偶联方式，其药物均一性差，对病人造成较严重的毒副作用，限制了其临床用药量，直接影响了其临床治疗效果。
技术实现思路
：本专利技术的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)具有通式：2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload。其中2C1是亲本抗体2A1轻链205位缬氨酸(V)改造为半胱氨酸(C)后的抗体。2C1的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:1，2C1的轻链氨基酸序列为SEQIDNO:12。2C1的亲本抗体2A1重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:1，2A1的轻链氨基酸序列为SEQIDNO:14。2C1保持了其亲本抗体2A1与抗原结合的能力(亲和力)，抗原为人的野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)及人的突变型表皮生长因子受体(de2-7EGFR/EGRFvIII)。2C1通过其轻链205位改造的半胱氨酸巯基与mc-vc-PAB-payload进行抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联，毒素比抗体比例DAR为1.6-2.0。本专利技术的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)药物主要用于治疗表达EGFRvIII及过表达EGFRwt的肿瘤，包括脑胶质癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌、膀胱癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等。本专利技术记载的全新半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)相较非定点偶联的ADC具有药物均一性好，副作用小等优点，临床前研究结果显示其显著优于非定点偶联ADC。附图说明图1为HIC-HPLC检测2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDCDAR；图2A为SEC-HPLC检测2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC聚集情况；图2B为SEC-HPLC检测通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的2A1-mc-vc-PAB-MMAEADC样品；图3A为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC与2C1保持了2A1与抗原EGFRvIII的亲和力；图3B为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAFTDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOXTDC保持了2A1与抗原EGFRvIII的亲和力；图4A为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAEADC对EGFRwt过表达的人皮肤鳞癌细胞A431的IC50检测结果；图4B为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAFTDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAFADC、对EGFRwt过表达的人皮肤鳞癌细胞A431的IC50检测结果；图4C为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-PBDADC对EGFRwt过表达的人皮肤鳞癌细胞A431的IC50检测结果；图4D为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAEADC对表达EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50检测结果；图4E为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAFTDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAFADC对表达EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50检测结果；图4F为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-PBDADC对表达EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50检测结果；图4G为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38TDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC对表达EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50检测结果；图4H为2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DoxTDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-DoxADC对表达EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50检测结果；图5A为荷瘤小鼠药效检测1mg/kg剂量进行单次静脉给药结果；图5B为荷瘤小鼠药效检测6mg/kg剂量给药结果；图6A为大鼠毒性检测嗜中性粒细胞计数结果；图6B为大鼠毒性检测AST检测结果；图6C为大鼠毒性检测每天监测体重变化情况。实施例1mc的合成于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的马来酸酐3.5g(0.036mol)。反应液于120℃搅拌反应4～6h。反应完毕后，停止加热，自然冷却到室温。60℃减压浓缩除去大部分醋酸。所得棕黄色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有机层。有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到棕黄色油状本文档来自技高网...

【技术保护点】
半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，具有如下通式：2C1‑LC‑V205C‑mc‑vc‑PAB‑payload。

【技术特征摘要】
1.半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，具有如下通式：2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload。2.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：其中2C1是目标抗体轻链205位缬氨酸（V）改造为半胱氨酸（C）后的抗体，2C1重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:1，轻链氨基酸序列为SEQIDNO:12。3.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：包含一个成熟的重链可变区，其氨基酸序列至少有95%与SEQIDNO:1相同。4.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：包含一个成熟的轻链，其氨基酸序列至少有95%与SEQIDNO:12相同。5.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：其中mc-vc-PAB-OH连接子为：。6.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：其中Payload为小分子高活性细胞毒素，包括但不限于MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox；MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox分子式分别为：。7.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱义，王一茜，卓识，李杰，陈澜，余永国，
申请(专利权)人：四川百利药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川;51