GLP‑1类似物‑Fc融合蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种GLP‑1类似物‑Fc融合蛋白及其制备方法和用途。所述GLP‑1类似物‑Fc融合蛋白，其结构包括：GLP‑1类似物和抗体Fc片段。发明专利技术的GLP‑1类似物‑Fc融合蛋白有效增加了GLP‑1类似物的体内循环半衰期，增强GLP1类似物的体内和体外的活性及稳定性，提高与FcRn的亲和力，增强GLP1类似物体内组织系统的穿透性和跨细胞作用，提高药物的效果，减少药物的注射频次，减轻患者的疼痛和降低治疗成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种GLP-1类似物-Fc融合蛋白及其制备方法和用途。
技术介绍
人们对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的细胞水平进行了研究，结果发现在葡萄糖水平较低时，GLP-1与受体结合仅引起钙离子的少量内流与胰岛素分泌，而当葡萄糖水平较高时，ATP/ADP比例升高，则ATP依赖的钙离子通道开放时间延长，因此可引起大量钙离子内流与胰岛素分泌，由此引起的生理作用如下：1、增加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌；2、抑制胰高血糖素分泌，增加葡萄糖清除；3、延缓胃排空和诱发饱腹感、抑制食欲；4、还可以改善外周胰岛素抵抗。但在研究中，人们还发现天然GLP-1存在局限性，即它的半衰期特别短，分泌2-3分钟后就会被二肽基肽酶(DPP-IV)降解，即使外源性给予GLP-1，也同样很快会被DPP-VI降解。因此生产一种生理作用与GLP-1类似但不能很快被降解的物质即GLP-1类似物成为急需解决的技术问题。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种GLP-1类似物-Fc融合蛋白，及其制备方法和用途。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其结构包括：GLP-1类似物和抗体Fc片段。所述GLP-1类似物的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者与SEQIDNO.1所示序列具有80％以上的同源性，更优选地，具有90％以上的同源性，进一步优选为具有97％以上的同源性。如SEQIDNO.1所示的序列，具体为：HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGluGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyGlyGly。优选地，所述抗体Fc片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc。优选地，所述抗体Fc片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3～8之任一所示。优选地，所述GLP-1类似物和抗体Fc片段可直接连接或通过连接肽连接。当所述GLP-1类似物和抗体Fc片段直接连接时，所述GLP-1类似物的C端与抗体Fc片段的N端以肽键相连。当所述GLP-1类似物和抗体Fc片段通过连接肽连接时，所述连接肽的N端与所述GLP-1类似物C末端以肽键相连，所述连接肽的C端与抗体Fc片段的N端以肽键相连。优选地，所述连接肽氨基酸数量为≥2个。所述连接肽以G4S为单位的多单位连接实现。优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。在本案的较佳案例中，所述GLP-1类似物-Fc融合蛋白的序列如SEQIDNO.9～14之任一所示。本专利技术的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述GLP-1类似物-Fc融合蛋白。本专利技术的第三方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。本专利技术的第四方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。本专利技术的第五方面，提供一种制备前述GLP-1类似物-Fc融合蛋白的方法，包括：构建含有GLP-1类似物-Fc融合蛋白基因序列的表达载体，然后将含GLP-1类似物-Fc融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的GLP-1类似物-Fc融合蛋白。本专利技术的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采用CHO-S细胞。本专利技术的第六方面，提供前述GLP-1类似物-Fc融合蛋白用于制备糖尿病及相关疾病治疗药物的用途。本专利技术的第七方面，提供一种药物组合物，含有前述GLP-1类似物-Fc融合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。本专利技术的第八方面，公开了一种治疗糖尿病及其相关疾病的方法，为向对象施用本专利技术的GLP-1类似物-Fc融合蛋白。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术的GLP-1类似物-Fc融合蛋白有效增加了GLP-1类似物的体内循环半衰期，使其体内循环半衰期延长了0.8倍。(2)本专利技术的GLP-1类似物-Fc融合蛋白增强GLP-1类似物的体内和体外的活性及稳定性，使其活性提高1倍。(3)本专利技术的GLP-1类似物-Fc融合蛋白提高与FcRn的亲和力，增强GLP-1类似物体内组织系统的穿透性和跨细胞作用，提高药物的效果，减少药物的注射频次，减轻患者的疼痛和降低治疗成本。附图说明图1：构建重组融合蛋白表达质粒示意图。图2a：纯化后的样品的组分分别进行非还原(Non-reduced)的SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝(ComasieBlue)染色显影结果。图2b：纯化后的样品的组分分别进行还原(reduced)的SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝(ComasieBlue)染色显影结果。具体实施方式一、GLP-1类似物-Fc融合蛋白本专利技术的GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其结构包括：GLP-1类似物和抗体Fc片段。所述融合蛋白的结构中，第一区域为GLP-1类似物。所述GLP-1类似物可以是重组GLP-1。所述GLP-1类似物的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者与SEQIDNO.1所示序列具有80％以上的同源性，更优选地，具有90％以上的同源性，进一步优选为具有97％以上的同源性。对于本领域技术人员而言应当能够理解的是，当所述GLP-1类似物的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示序列同源性≥80％(优选为≥90％，进一步优选为≥97％)都可以与Fc融合，形成GLP-1类似物-Fc融合蛋白，效果是可以预期的。所述融合蛋白的结构中，第二区域为抗体Fc片段。所述抗体Fc片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc。只要不对本专利技术的专利技术目的产生限制即可。由于与GLP-1类似物相连的抗体Fc片段来源于免疫球蛋白IgG的恒定区，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG2，IgG3，IgG4均可以与GLP-1类似物结合。Fc融合主要是为了增加它的体内循环半衰期和降低生产成本，而Fc介导的“抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用”(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)功能是不必要的，甚至可能产生有害副作用。为了得到不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc，本专利技术专利技术人对人的IgG4的Fc片段进行了修饰，突变或杂合。本专利技术一优选实施例中，分别获得IgG-Fc、IgG-Fc(QA)、IgG-Fc(QL)、IgG-Fc(N434S)、hyFc、hyFcMutation。IgG-Fc的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：GluSerLysTyrGlyProProCysProSerCysProAlaProGluPheLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValArgV本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种GLP‑1类似物‑Fc融合蛋白，其结构包括：GLP‑1类似物和抗体Fc片段。

【技术特征摘要】
1.一种GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其结构包括：GLP-1类似物和抗体Fc片段。2.根据权利要求1所述的GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1类似物的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者与SEQIDNO.1所示序列具有80％以上的同源性。3.根据权利要求1所述的GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其特征在于，所述抗体Fc片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc。4.根据权利要求1所述的GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其特征在于，所述抗体Fc片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3～8之任一所示。5.根据权利要求1所述的GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其特征在于，GLP-1类似物和抗体Fc片段直接连接或通过连接肽连接。6.根据权利要求1所述的GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1类似物-F...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，周永春，厉颖，张亚楠，伏迪，张秋萍，谭婉珑，李丽丽，
申请(专利权)人：上海凯茂生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31