一种猪戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白的制备方法及其ORF2蛋白和检测试剂盒技术

本发明专利技术以表达HEV ORF2 C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用引物扩增该目的片段；连接pMAL‑c5X载体，获得pMAL‑c5X‑ORF2重组质粒，原核表达获得重组蛋白。该蛋白能与猪戊型肝炎病毒抗体发生反应，利用该蛋白建立液相芯片检测技术，对猪常见的其他疾病阳性血清无交叉反应，其批内、批间变异系数分别为5%、6.6%。对102份临床血清样本检测结果显示，该方法与商品化ELISA试剂盒符合率为93.1%，关联性卡方检验显示两个方法具有一致性（P<0.01）。本研究为临床HEV血清抗体的检测提供了一种特异、灵敏的新型快速检测技术，为建立猪病多重检测方法提供了基础。

Method for preparing recombinant protein of swine hepatitis E virus ORF2 and its ORF2 protein and detection kit

The expression of HEV ORF2 C period of 337th to 645th amino acid nucleotide sequence fragment as target fragment and the fragment amplified by primer pMAL; connecting c5X vector, pMAL c5X ORF2 recombinant plasmid, prokaryotic expression of the recombinant protein. This protein can react with swine hepatitis E virus antibody, using the protein liquid chip detection technology, no cross reaction with other disease positive serum of pig common, the intra and inter batch variation coefficients were 5% and 6.6%. The results of 102 clinical serum samples showed that the coincidence rate between the method and the commercial ELISA kit was 93.1%, and the correlation chi square test showed that the two methods were consistent (P< 0.01). This study provides a new technology for rapid detection of specific and sensitive for the detection of clinical serum antibody of HEV, provide a basis for the establishment of multiple detection method.

【技术实现步骤摘要】
一种猪戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白的制备方法及其ORF2蛋白和检测试剂盒
本专利技术涉及病毒检测
，更具体地，涉及一种猪戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白的制备方法及其ORF2蛋白和检测试剂盒。
技术介绍
戊型肝炎（HepatitisE，HE）是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）引起的以黄疸为主要表现的急性病毒性肝炎，主要经粪-口途径传播。该病主要流行于卫生设施不完善的发展中国家（如亚洲和非洲），在发达国家（如美国和一些欧洲国家）也存在散发的情况。戊型肝炎的致死率（1～4%）比甲型肝炎（0.1～2%）的致死率要高，并且对孕妇的致死率能高达30%。HEV具有一个血清型，四个基因型，基因1和2型只感染人，主要流行于亚洲、非洲、墨西哥。基因3、4型宿主范围较广，除了可感染人和家猪外，也可感染鸡、鹿、兔子、老鼠等其他动物。基因3型主要流行于美国、加拿大、阿根廷、西班牙、法国、澳大利亚、荷兰、新西兰等。基因4型分布在中国，日本，印度和越南。因此，戊型肝炎已经是一个重要的公共卫生问题而不只是食物安全和人畜共患病等潜在的风险。LuminexxMAP（Flexiblemulti-analyteprofing）液相芯片技术有机整合了激光分析技术、流式细胞技术等多项最新科技成果，可用于蛋白、核酸和配体受体等荧光生物学反应的检测，具有高通量、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广等优势。其原理是以不同荧光编码的微球为载体，进行抗原-抗体、受体-配体、酶-底物结合反应以及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光判断微球的荧光编码及报告分子的荧光强度，从而达到快速准确的定性和定量检测的目的。目前，液相芯片检测技术已被广泛应用于医疗保健、食品生产、环境卫生等领域的微生物检测领域，并在在呼吸道、虫媒介等病毒检测方面也广泛应用。实验室检测HEV主要采用分子生物学和血清学。PCR是检测HEVRNA最常用的方法，核酸存在于血清、胆汁、粪便中的时间非常短暂，出现临床症状1～2周前可以检测到HEVRNA，粪便容易受到污染，病毒载量低，该检测方法出现不稳定结果。12周龄的猪感染HEV出现病毒血症3周后可检测出IgM，可持续5～7周。当IgM升高3周后，IgG抗体为阳性，可持续至4～5个月，因此，实验室常采用ELISA监测HEV抗体。目前，商品化的ELISA试剂盒以1型HEV抗原为主，很少有以4型HEV作为抗原建立检测方法的研究，且国内没有猪HEV液相蛋白检测方法的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种猪戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供上述方法制备得到的猪戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白。本专利技术的第三个目的是提供所述猪戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白作为免疫原在制备检测猪戊型肝炎病毒的试剂中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种检测猪戊型肝炎病毒的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种猪戊型肝炎病毒重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1.以表达HEVORF2C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-c5X-ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。HEV基因组为单股正链RNA，大小约7.2kb，具有3个开放阅读框（openreadingframe,ORF）：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2为HEV主要的结构基因编码区，编码衣壳蛋白，该蛋白富含多个抗原表位，结构复杂，除N端有少数几个外，其余抗原表位主要分布在C端2/3处。ORF2C末端编码的452aa～617aa是HEV中和抗原表位的位置，且不同基因型能够发生交叉中和反应，提示存在共同中和抗原表位。因此，本研究选取ORF2C段337～654aa片段进行原核表达，成功表达了具有免疫原型的ORF2蛋白，以期建立猪戊型肝炎病毒检测方法。使用pMAL-C5X载体的目的是增加目的重组蛋白的可溶性，借以保持其天然空间结构及抗原性。但用于纯化含有MBP标签重组蛋白的Amylose树脂纯化效率较低（即重组蛋白的纯化效率和纯化度低），因此在上述pMAL-c5X重组质粒的基础上，在ORF2基因下游引入6*His标签基因。其目的是在后期纯化过程中使用Ni2+纯化填料，提高目的蛋白的纯化效率。优选地，S2所述诱导表达条件为：IPTG终浓度0.8mmol/L，温度30℃，时间5h。本专利技术还提供所述方法获得的猪戊型肝炎病毒重组蛋白。本专利技术还提供所述猪戊型肝炎病毒重组蛋白作为免疫原在制备检测猪戊型肝炎病毒的试剂中的应用。本专利技术以液相芯片技术为基础，以ORF2重组蛋白作为抗原，建立一种检测猪戊型肝炎病毒的新方法，因此，本专利技术还提供一种检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2，是将所述猪戊型肝炎病毒重组蛋白与羧基化荧光微球012偶联获得。具体地，所述猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2的制备方法，包括以下步骤：S1.羧基化荧光微球的活化：将清洗后的羧基化荧光微球012分别依次重悬于磷酸氢二钠缓冲液、Sulfo-NHS溶液和EDC溶液中进行活化；S2.活化后的羧基化荧光微球012悬液中加入猪戊型肝炎病毒重组蛋白进行孵育，并用PBS-TBN重悬即得。本专利技术还提供一种检测猪戊型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒含有所述的猪戊型肝炎病毒重组蛋白，该重组蛋白可用于基于抗原抗体原理的免疫反应。优选地，所述检测猪戊型肝炎病毒的试剂盒含有所述的猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2。具体地，针对利用羧基化荧光微球12-ORF2进行液相芯片检测的技术，所述试剂盒还含有生物标记的鸡抗鼠IgG抗体或者兔抗猪IgG抗体、链霉素-藻红蛋白。优选地，所述生物标记的鸡抗鼠IgG抗体的稀释度为1：1000，兔抗猪IgG抗体的稀释度为1：5000，链霉素-藻红蛋白的稀释度为1：1000。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首先提供了猪戊型肝炎病毒重组蛋白的制备方法：以表达HEVORF2C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-c5X-ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达获得重组蛋白。该蛋白能够与猪戊型肝炎病毒抗体发生反应，说明了重组蛋白具有良好的抗原性，利用该重组蛋白建立液相芯片检测技术，液相蛋白芯片检测方法对猪常见的其他疾病阳性血清无交叉反应，其批内、批间变异系数分别为5%、6.6%。对102份临床血清样本检测结果显示，该方法与商品化ELISA试剂盒符合率为93.1%，关联性卡方检验显示两个方法具有一致性（P<0.01）。本研究为临床HEV血清抗体的检测提供了一种特异、灵敏的新型快速检测技术，为建立猪病多重检测方法提供了基础。附图说明图1为ORF2基因的PCR扩增结果，其中，M：DL-2000Marker，1：PCR扩增产物。图2为重组质粒pMAL-c5X－ORF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪戊型肝炎病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 以表达HEV ORF2 C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；S2. 连接pMAL‑c5X载体，获得pMAL‑c5X‑ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。

【技术特征摘要】
1.一种猪戊型肝炎病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.以表达HEVORF2C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-c5X-ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。2.根据权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，S2所述诱导表达条件为：IPTG终浓度0.8mmol/L，温度30℃，时间5h。3.权利要求1或2所述方法获得的猪戊型肝炎病毒重组蛋白。4.权利要求3所述猪戊型肝炎病毒重组蛋白作为免疫原在制备检测猪戊型肝炎病毒的试剂中的应用。5.一种检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2，其特征在于，是将权利要求3所述猪戊型肝炎病毒重组蛋白与羧基化荧光微球012偶联获得。6.权利要求5所述猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12...

【专利技术属性】
技术研发人员：王衡，张桂红，纪方晓，陈济铛，梁焕斌，朱婉君，古洪浪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44