一种PLA2R‑THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及医学领域，特别涉及一种PLA2R‑THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。该融合蛋白包括与磷脂酶A2受体(PLA2R)至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)至少85％序列同源的第二区。本发明专利技术制备的融合蛋白综合了PLA2R和THSD7A两个抗原的抗原表位，同时具备了这两种抗原的免疫反应性，且该融合蛋白提高了对自发性MN相关自身抗体的检出率，检出率可达78.1％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学领域，特别涉及一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。
技术介绍
原发性膜性肾小球肾炎(pMGN)，又称为特发性膜性肾病(IMN)，是一种肾小球慢性炎症性疾病，是肾病综合征中常见的肾病类型之一。该病典型的特征是蛋白尿，随着尿蛋白含量的增加，有肾衰竭发展趋势。大多数的pMGN病人表现有肾病综合征，有的伴有水肿，体重增加，小便减少。pMGN与继发性膜性肾小球肾炎(sMGN)不同，sMGN是继发性疾病或并发性疾病。药物治疗、滥用毒品、感染性疾病、其他的自身免疫疾病和肿瘤都可能导致sMGN的发生。同时，sMGN可以随着根本疾病的治疗而好转。MGN的“金标准”为肾脏穿刺，肾组织的病理学和电镜检查。诊断的标志是免疫复合物在肾小球基底膜外侧的沉积。越来越多的证据显示IMN是一种自身免疫疾病，已经发现的自身免疫抗原磷脂酶A2受体(PLA2R)和1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)对IMN的诊断都有一定的诊断价值。据报道，IMN病人血清中抗PLA2RIgG自身抗体阳性率为70％-75％，而在健康人、系统性红斑狼疮病人或其他肾病患者未检出，另外，IMN病人血清中THSD7A抗体的阳性率为5％-10％。多篇专利文献中也显示了这两种抗原在自发性膜性肾病诊断中的应用，如：CN102159951B专利中公开了利用PLA2R抗原进行自发性膜性肾病(MN)的免疫分析、制备试剂、治疗剂以及诊断和预后评估方法。通过酶联免疫吸附分析、浊度测量免疫分析等免疫分析针对PLA2R为反应性的血清自身抗体，达到对膜性肾病的诊断及预后评估。WO2016/012542A1专利中公开了利用THSD7A抗原进行自发性膜性肾病(MN)的免疫分析、制备试剂、治疗剂以及诊断和预后评估方法。通过酶联免疫吸附分析、浊度测量免疫分析等免疫分析针对PLA2R为反应性的血清自身抗体，达到对膜性肾病的诊断及预后评估。WO2015185949A1中公开了对PLA2R的主要抗原表位的多肽序列的研究及其在预防、治疗肾病中的用途。PLA2R和THSD7A是自发性膜性肾病的两个自身抗原，对自发性MN的检出率分别为70％-75％和5％-10％，单独使用时都有一定的漏检率。因此，急需提供一种能够提高IMN的检出率，增加检测敏感性的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。该融合蛋白可显著提高IMN的检出率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种融合蛋白，融合蛋白包括与磷脂酶A2受体(PLA2R)至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)至少85％序列同源的第二区。本研究发现，PLA2R和THSD7A两种抗体在IMN患者中仅有1％同时出现的概率，其余情况是相互排斥的出现的。了解了这一特点之后，本专利技术利用基因工程的方法构建一个包含PLA2R和THSD7A抗原多肽的融合蛋白，通过这种新蛋白检测MN患者样品中相关自身抗体的水平。该融合蛋白能与来自受试者样品中的相关抗体结合形成抗体-蛋白质复合物，并且该复合物可被测量。与已有的PLA2R和/或者THSD7A单独检测的方法相比，这种新的融合蛋白抗体的检测能提高自发性MN的检出率，增加检测的敏感性，同时，创造性的提供了一种新颖的针对自发性MN的快速、精确、成本低、安全以及简便的方法。在本专利技术提供的一些实施例中，与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于融合蛋白的N端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的C端。在本专利技术提供的另一些实施例中，与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于融合蛋白的C端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的N端。作为优选，融合蛋白包括与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区。在本专利技术提供的一些实施例中，与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区位于融合蛋白的N端，与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区位于融合蛋白的C端。在本专利技术提供的另一些实施例中，与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区位于融合蛋白的C端，与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区位于融合蛋白的N端。本专利技术还提供了编码该融合蛋白的基因。本专利技术还提供了该融合蛋白的制备方法，包括：1、提取获得人组织的总RNA；2、利用通用引物制备cDNA；3、设计PCR引物扩增PLA2R和THSD7A的全长片段；4、连接PLA2R和THSD7A的全长片段，获得重组基因；所述的重组基因为PLA2R-THSD7A序列或THSD7A-PLA2R序列；5、将重组基因转入表达载体，表达获得PLA2R-THSD7A融合蛋白或THSD7A-PLA2R融合蛋白。本专利技术还提供了该融合蛋白在制备自发性膜性肾病诊断试剂中的应用。本专利技术还提供了一种自发性膜性肾病诊断试剂盒，包括本专利技术制备的融合蛋白。在本专利技术中，使用该融合蛋白作为抗原，通过基于抗原抗体反应的免疫学方法检测受试者样品中的自发性MN的相关自身抗体水平。作为优选，自发性膜性肾病诊断试剂盒还包括固相支持物和经过标记的第二抗体。在本专利技术提供的实施例中，固相支持物可以为生物载片、多孔平板、测试条、乳胶珠子或微球体。在本专利技术提供的实施例中，经过标记的第二抗体的标记物为生物酶、具有荧光化合物或金属的标记物或者具有化学发光化合物的标记物。本专利技术还提供了非诊断目的的检测PLA2R抗体和/或THSD7A抗体的方法，包括：本专利技术制备的融合蛋白包被固定于固相支持物上；在适于抗原抗体结合的条件下，使待测样品与固相支持物上的融合蛋白一同温育；洗涤去除样品中未结合的抗体；在适于抗原抗体结合的条件下，加入经标记物标记的第二抗体进行温育；洗涤去除未结合的标记的第二抗体；将标记物转化为可检测的信号，就检测信号的强弱表示待测样品中PLA2R抗体和/或THSD7A抗体的水平。在本专利技术提供的实施例中，待测样品为血液样品，如血清或血浆。作为优选，待测样品为人的血液样品。作为优选，第二抗体为特异于人类的检测抗体。在本专利技术中，对于标记物的信号转化是利用对特定标记物的显色底物，或者是特定激发光的仪器读取信号。例如：所述检测抗体用辣根过氧化物酶标记，信号转化利用显色底物TMB；所述标记物是荧光化合物，信号转化就通过荧光信号检测仪读取；所述抗体用胶体金标记，信号转化就利用标记物在特定位置大量聚集所产生的肉眼可见的颜色斑点表示。另外，也可以通过测量免疫反应形成的抗原-抗体复合物所产生的光散射强度，通过比浊法来分析测定样品中相关自身抗体的水平。本专利技术的试剂盒可以是ELISA试剂盒，也可以是其他的免疫检测试剂盒。在ELISA试剂盒中包括：在固相支持物上包被过量的本专利技术所述的融合蛋白；将待测样品添加到固定的融合蛋白上，所述蛋白与相应的待测抗体结合而形成相应的复合物；再与特异于自身抗体的标记二抗结合，最终检测到的标记物的量即可作为样品中所存在的相关自身抗体的度量。作为优选，试剂盒包含反应区和数据读取区，反应区是指加入样品的反应区域与反应程序，数据读取区是在反应完成或终止之后，利用特定的仪器(酶标仪等)对反应结果的记录。作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于所述融合蛋白的N端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于所述融合蛋白的C端。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于所述融合蛋白的C端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于所述融合蛋白的N端。4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区和...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊祖应，王洪涛，林俊，刘尧，张永顶，张大准，张巧，马伟民，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44