一种检测试纸条在制备检测PLA2R抗体的试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种PLA2R抗体的检测试纸条及检测方法。本发明专利技术所述PLA2R抗体的检测试纸条，包括在粘性底板上依次搭接样品垫，结合垫1，结合垫2、NC膜和吸水纸；所述结合垫1上喷涂有PLA2R生物素化偶联物，所述结合垫2喷涂有SA荧光微球偶联物和DNP‑BSA荧光微球偶联物，所述NC膜上包被有捕获体作为检测线，所述NC膜上还包被有抗DNP‑BSA抗体作为质控线。本发明专利技术采用捕获法检测PLA2R抗体的试纸条显色速度更快，从加样到判读结果只要7min，检测时间更短，试纸条显色信号更强，弱阳不易发生漏检，特异性更好，能定量、准确、便捷的测试人血清、血浆及全血中PLA2R抗体的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种检测试纸条在制备检测PLA2R抗体的试剂盒中的应用本申请是申请日为2018年01月30日、专利技术名称为“一种PLA2R抗体的检测试纸及检测方法”、申请号为201810091384.0的专利技术的分案申请。
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种PLA2R抗体的检测试纸条及检测方法。
技术介绍
膜性肾病(MN)是成人肾病综合征最常见的病理类型之一，其特征性的病理学改变是肾小球毛细血管袢上皮侧可见大量免疫复合物沉积。MN按发病原因可分为特发性膜性肾病(IMN)和继发性膜性肾病(SMN)两大类。IMN是一种肾小球慢性炎症性疾病，大多与抗磷脂酶A2受体抗体相关，抗磷脂酶A2受体抗体与足细胞上的相应抗原结合，形成原位免疫复合物，继而通过旁路途径激活补体，形成C5b-9膜攻击复合物，损伤足细胞，破坏肾小球滤过屏障，其典型特征是蛋白尿，随着尿蛋白含量的增加，有肾衰竭的发展趋势。而SMN与IMN不同，是继发性疾病或并发性疾病，药物治疗、滥用毒品、感染性疾病、其他的自身免疫疾病和肿瘤都可能导致SMN的发生。如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，乙肝病毒感染，以及药物、毒物、肿瘤或环境因素等。引起继发性膜性肾病的药物主要有一些金制剂、汞、青霉胺、布洛芬、双氯芬酸等。同时，SMN可以随着根本疾病的治疗而好转。IMN和SMN的诊断主要依靠临床表现和肾脏穿刺。肾脏穿刺即肾活检，也称肾穿刺活检术。是一种侵入式的创伤诊断方法，对病人有一定的伤害，而根据临床表现的诊断需要一定的经验，并且也需要组织病理学的验证。近年来的研究和文献报道，IMN是一种自身免疫性疾病，已经发现的自身免疫抗原磷脂酶A2受体(PLA2R)是其主要靶抗原，对IMN的诊断阳性率可达70％-82％，且在其他疾病和正常人血清样本中未检测出该抗体。血清学PLA2R抗体定量检测可以为特发性的膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。因此开发非创伤、低风险、快速、安全、廉价、精确的定量检测血清、血浆和全血中IMN相关自身抗体的含量的方法对特发性的膜性肾病的检测具有十分重要的意义。现在已有欧蒙公司的间接免疫荧光法试剂盒测试血清中Pla2r抗体，但间接免疫荧光法操作过程繁琐，检测时间长。申请号为201510245291.5的中国专利公开了采用双抗原夹心测试血清PLA2R抗体检测试纸条，但该方法判读结果至少需要15min，显色信号弱，容易发生弱阳性的漏检。申请号为201710047530.5的中国专利公开了采用胶体金免疫层析技术测试血清pla2r抗体的，但该方法无法满足定量测试的要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术中操作过程繁琐、检测时间长、显色信号弱、无法定量检测的缺陷，提供一种能定量、准确、便捷的测试人血清、血浆和全血中PLA2R抗体的检测试纸条及检测方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测试纸条在制备检测PLA2R抗体的试剂盒中的应用，其中所述检测试纸条，包括在粘性底板上依次搭接样品垫、结合垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫1上喷涂有PLA2R生物素化偶联物，所述结合垫2喷涂有亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物，所述硝酸纤维素膜上包被有捕获体作为检测线，所述硝酸纤维素膜上还包被有抗DNP-BSA抗体作为质控线。一种PLA2R抗体的检测试纸条，包括在粘性底板上依次搭接样品垫，结合垫1，结合垫2、硝酸纤维素膜(NC)和吸水纸；所述结合垫1上喷涂有PLA2R生物素化偶联物，所述结合垫2喷涂有亲和素(SA)荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物，所述硝酸纤维素膜上包被有捕获体作为检测线，所述硝酸纤维素膜上还包被有抗DNP-BSA抗体作为质控线。其中，所述检测试纸条中所述PLA2R生物素化偶联物中所述PLA2R包括但不限于为PLA2R分子全长或部分片段的蛋白，或能起到PLA2R蛋白类似作用的变异体、类似物、替代物。所述PLA2R可以是天然纯化的PLA2R，也可以是基因工程技术重组获得的。作为优选，所述PLA2R分子部分片段为与THSD7A蛋白序列组合的PLA2R中的分子片段。作为优选，所述的检测试纸条中所述荧光微球的粒径为200nm。作为优选，所述的检测试纸条中所述捕获体为抗人IgG抗体或能与人IgG抗体结合的物质，如蛋白A或蛋白G。更优选为鼠抗人IgG，如鼠抗人IgG4。本专利技术还提供了所述PLA2R抗体的检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：A、将PLA2R蛋白生物素化获得PLA2R生物素化偶联物，喷涂在结合垫1上；B、分别将预处理的亲和素和DNP-BSA与活化的荧光微球偶联，获得亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物喷涂在结合垫2上；C、将捕获体包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗DNP-BSA抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线；D、在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有PLA2R生物素化偶联物的结合垫1、喷涂有亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物的结合垫2、包被捕获体和抗DNP-BSA抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸。本专利技术对PLA2R蛋白生物素化的方法没有限定，可以采用本领域技术人员公知的方法进行。在一些实施方案中，本专利技术采用常用的生物素化的试剂盒对PLA2R蛋白进行生物素标记。如使用Thermo公司的Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒步骤A中将PLA2R生物素化偶联物喷涂在结合垫1上的具体操作为用喷金划膜仪将PLA2R生物素化偶联物以2μl/cm的量喷涂结合垫1，37℃烘箱干燥2h。本专利技术所述检测试纸条的制备方法步骤B所述偶联优选为将活化的荧光微球离心去上清后，用pH7.0～8.050mMMES缓冲液洗涤后，按每100μl微球加入0.1mg～0.2mg亲和素或0.2～0.4mgDNP-BSA，室温混匀反应1-2h。本专利技术所述检测试纸条的制备方法步骤B中所述亲和素和DNP-BSA在与荧光微球偶联前需要进行预处理。优选为分别用pH7.0～8.050mMMES缓冲液透析亲和素和DNP-BSA三遍。步骤B中所述荧光微球需要预先活化处理。所述微球的活化的具体方法优选为微球用50mMpH6.0～6.5MES溶液洗涤后，按每100μl微球加入0.2～0.4μgNHS(N-羟基丁二酰亚胺)和0.2-0.4μgEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)室温混匀反应30～40min。进一步作为优选，步骤B中所述亲和素和DNP-BSA与活化的荧光微球偶联后还包括封闭的步骤。更优选的，所述封闭的具体操作为加入BSA至浓度为1％～5％(g/ml)，室温混匀反应30～40min。即加入BSA至浓度为每100ml1g～5g，室温混匀反应30～40min。亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物可以现用现制，也可预先制备后保存于保存液中。所述保存方法具体为将亲和素荧光微球偶联物或DNP-BSA荧光微球偶联物用pH8.510mmol/L硼酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测试纸条在制备检测PLA2R抗体的试剂盒中的应用，其中所述检测试纸条，包括在粘性底板上依次搭接样品垫、结合垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫1上喷涂有PLA2R生物素化偶联物，所述结合垫2喷涂有亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物，所述硝酸纤维素膜上包被有捕获体作为检测线，所述硝酸纤维素膜上还包被有抗DNP-BSA抗体作为质控线。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测试纸条在制备检测PLA2R抗体的试剂盒中的应用，其中所述检测试纸条，包括在粘性底板上依次搭接样品垫、结合垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫1上喷涂有PLA2R生物素化偶联物，所述结合垫2喷涂有亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物，所述硝酸纤维素膜上包被有捕获体作为检测线，所述硝酸纤维素膜上还包被有抗DNP-BSA抗体作为质控线。


2.根据权利要求1所述的应用，所述PLA2R生物素化偶联物中PLA2R为PLA2R分子全长或部分片段的蛋白，或能起到PLA2R蛋白类似作用的变异体、类似物、替代物。


3.根据权利要求1所述的应用，所述检测试纸条中荧光微球的粒径为200nm；所述捕获体为抗人IgG抗体或能与人IgG抗体结合的物质。


4.权利要求1所述的应用，所述检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、将PLA2R蛋白生物素化获得PLA2R生物素化偶联物，喷涂在结合垫1上；
B、分别将预处理的亲和素和DNP-BSA与活化的荧光微球偶联，获得亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物喷涂在结合垫2上；
C、将捕获体包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗DNP-BSA抗体包被到硝酸纤维素膜上作为质控线；
D、在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有PLA2R生物素化偶联物的结合垫1、喷涂有亲和素荧光微球偶联物和DNP-BSA荧光微球偶联物的结合垫2、包被捕获体和抗DNP-BSA抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸。


5.根据权利要求4所述的应用，所述检测试纸条的制备方法步骤B所述偶联为将活化的荧光微球离心去上清后，用pH7.0～8.050mMMES缓冲液洗涤后，按每100μl微球加入0.1mg～0.2mg亲和素或0.2～0.4mgDNP-BSA，室温混匀反应1～2h。


6.根据权利要求4所述的应用，所述检测试纸条的制备方法所述步骤C具体为分别用包被液稀释捕获体和抗DNP-BSA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪涛，张永顶，张大准，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44