蛋白偶联试剂、蛋白偶联微球、微孔板及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及蛋白偶联试剂、蛋白偶联微球、微孔板及其应用。本发明专利技术提供了蛋白偶联试剂，包括试剂I和试剂II；所述试剂I包括：MES、EDC和NHS；所述试剂II包括：抗磷脂酶A2重组蛋白。本发明专利技术通过在微球偶联蛋白后包被微孔板，扩大了载体表面积，提高酶标板灵敏度。灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
蛋白偶联试剂、蛋白偶联微球、微孔板及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及蛋白偶联试剂、蛋白偶联微球、微孔板及其应用。

技术介绍

[0002]化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay，cLEIA)属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免分析完全相同：通过包被于聚苯乙烯板的抗原或抗体捕获样本中特异性物质，并与酶标记生物活性物质组合成免疫复合物。检测时，利用该免疫复合物上的酶催化底物发光，化学发光分析等设备对催化所发出的光量子进行测定得到最终的检测结果。
[0003]酶标板在参与免疫学反应的抗原、抗体、标记抗体或抗原的纯度、浓度和比例；缓冲液种类、浓度和离子强度、pH值和反应温度、时间等条件起着关键作用。此外，作为载体的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附也起着重要作用。
[0004]乳胶微球是免疫学和磁性微球结合而发展的一类新型材料，由于其高效、低毒等特性，目前在生物化学领域、医药领域、食品检测领域应用广泛。
[0005]抗体与乳胶微球的偶联是将单克隆抗体与带有功能基团的微球偶联，抗体与微球连接的方式有两种：共价偶联(covalent coupling)和物理吸附(physical absorption)。物理吸附非常不稳定，在一定的条件下很容易脱落，而共价偶联是抗体与微球表面的基团共价结合，使抗体稳固地结合在微球上。微球上的醛基、环氧基等基团可以直接和目标分子上的氮基结合，而含其他基团的微球则需要进行活化才能与目标分子连接。常用的活化方法有：碳二亚胺法、重氮法、烃化法、溴化氰法、戊二醛法、伍德沃德试剂K法等。
[0006]固相载体在酶免分析测定过程作为吸附剂和容器，不参与化学反应，最常用的是聚苯乙烯。包被是将蛋白结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
[0007]在现有技术中，通常在包被的时候，将包被液加入到酶标板中，包被液中的蛋白会吸附到聚苯乙烯上，在固定的面积内，聚苯乙烯板的位置是有限的，因此所吸附的蛋白有限。在上述包被的微孔板中检测，检测试验的灵敏度较低。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了蛋白偶联试剂、蛋白偶联微球、微孔板及其应用。本专利技术通过在微球偶联蛋白后包被微孔板，扩大了载体上蛋白面积，提高酶标板灵敏度。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术提供了蛋白偶联试剂，包括试剂I和试剂II；所述试剂I包括：MES、EDC和NHS；所述试剂II包括：抗磷脂酶A2重组蛋白。
[0011]在本专利技术的一些实施方案中，上述蛋白偶联试剂中所述MES采用MES溶液的形式添
加；所述MES溶液的浓度为0.05mol/L，pH值为6.0；上述蛋白偶联试剂中所述EDC与所述NHS的质量比为1:15。
[0012]本专利技术还提供了上述蛋白偶联试剂在制备蛋白偶联微球中的应用。
[0013]本专利技术还提供了蛋白偶联微球的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1：取生物磁珠活化后，获得活化后的微球；
[0015]S2：取所述活化后的微球，偶联后，获得所述蛋白偶联微球；
[0016]S1中所述活化和S2中所述偶联采用上述蛋白偶联试剂。
[0017]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述生物磁珠包括羧基微球。
[0018]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述活化采用所述试剂I；所述生物磁珠与所述MES的体积比为1:2500。
[0019]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述偶联采用试剂II；所述活化后的微球体积与所述抗磷脂酶A2重组蛋白的质量比为1:1～5。
[0020]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述MES溶液的浓度为0.05mol/L，pH值为6.0。
[0021]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述MES溶液的体积为500μL。
[0022]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述生物磁珠的体积为0.2μL。
[0023]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述EDC与所述NHS的质量比为1:15。
[0024]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述EDC的质量为0.03mg。
[0025]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述NHS的质量为0.045mg。
[0026]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述抗磷脂酶A2重组蛋白的质量为20～100μg。
[0027]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述抗磷脂酶A2重组蛋白的质量为20μg、50μg或100μg。
[0028]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述活化的时间为30min，温度为20～25℃。
[0029]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述偶联的时间为20min，温度为20～25℃。
[0030]本专利技术还提供了上述蛋白偶联试剂或上述制备方法获得的蛋白偶联微球在制备微孔板中的应用。
[0031]本专利技术还提供了微孔板的制备方法，取上述蛋白偶联微球封闭、离心、去上清、超声、稀释后铺板，获得所述微孔板。
[0032]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述封闭的时间为30min，温度为20～25℃。
[0033]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述离心的转速为16000rpm，时间为30～60min。
[0034]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述离心包括第一离心和第二离心；所述第一离心的转速为16000rpm，时间为30min；所述第二离心的转速为16000rpm，时间为30min。
[0035]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述第二离心包括与50mm TB缓冲液混合的步骤。
[0036]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述超声的参数为10％，3/3，时间为2min。
[0037]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述铺板后还包括包被、封闭和干燥的步骤。
[0038]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述包被的时间为18h，温度为2～8℃。
[0039]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述封闭的时间为1h，温度为20～25℃。
[0040]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述干燥的时间为2h，温度为37℃。
[0041]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述稀释采用CB缓冲液；所述稀释后的浓度为0.1～0.2μg/mL。
[0042]在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白偶联试剂，其特征在于，包括试剂I和试剂II；所述试剂I包括：MES、EDC和NHS；所述试剂II包括：抗磷脂酶A2重组蛋白。2.如权利要求1所述的蛋白偶联试剂，其特征在于，所述MES采用MES溶液的形式添加；所述MES溶液的浓度为0.05mol/L，pH值为6.0；所述EDC与所述NHS的质量比为1:15。3.如权利要求1或2所述的蛋白偶联试剂在制备蛋白偶联微球中的应用。4.蛋白偶联微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取生物磁珠活化后，获得活化后的微球；S2：取所述活化后的微球，偶联后，获得所述蛋白偶联微球；S1中所述活化和S2中所述偶联采用如权利要求1或2所述的蛋白偶联试剂。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1中所述活化采...

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟民，梁香禄，许元峰，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：