OX40L融合蛋白及其用途制造技术

本披露提供包括人IgG4 Fc结构域、三聚结构域、和Ox40配体的受体结合域的OX40L huIgG4融合多肽亚基，其中该融合多肽亚基可自组装成六聚体蛋白。还提供制造融合多肽亚基和六聚体蛋白的方法，以及例如，用于治疗癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文结合在此。所述ASCII副本创建于2015年5月21日，名称为OX40F-101W01_SL.txt并且大小为31,496字节。背景OX40(CD134；TNFRSF4)是主要存在于活化的CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)和自然杀伤(NK)细胞上的肿瘤坏死因子受体(克罗夫特(Croft)等人，2009，免疫学评论(ImmunolRev)，229：173-91)。OX40具有一个已知的内源性配体，OX40配体(OX40L；CD152；TNFSF4)，该OX40配体以三聚体的形式存在，并且可以使OX40聚集，在T细胞内导致有效的细胞信号传导事件(克罗夫特(Croft)等人，2009，免疫学评论(ImmunolRev)，229：173-91)。在活化的CD4+和CD8+T细胞上通过OX40发信号导致细胞因子产生的增强、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆T细胞池的扩增(延森(Jensen)等人，2010，肿瘤学研讨会(SeminOncol)，37：524-32)。另外，OX40在Treg细胞上发信号抑制Treg的扩增，关闭Treg的诱导和阻断Treg抑制性功能(Voo等人，2013，免疫学杂志(JImmunol)，191：3641-50；Vu等人，2007，血液(Blood)，110：2501-10)。免疫组织化学研究和早期流式细胞术分析表明，OX40在浸润宽范围的人类癌症的T细胞上表达(巴鲁阿(Baruah)等人，2011，免疫生物学(Immunobiology)，217：668-675；柯蒂(Curti)等人，2013，癌症研究(CancerRes)，73：7189-98；兰丹尼(Ladanyi)等人，2004，临床癌症研究(ClinCancerRes)，10：521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美国外科杂志(AmJSurg)，183：512-8；Ramstad等人，2000，美国外科杂志(AmJSurg)，179：400-6；Sarff等人，2008，美国外科杂志(AmJSurg)，195：621-5，讨论625；韦托(Vetto)等人，1997，美国外科杂志(AmJSurg)，174：258-65)。在肿瘤浸润淋巴细胞上的OX40表达与若干种人类癌症中的较长生存期相关，表明OX40信号可在建立抗肿瘤免疫应答中发挥关键的作用(兰丹尼(Ladanyi)等人，2004，临床癌症研究(ClinCancerRes)，10：521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美国外科杂志(AmJSurg)，183：512-8)。在各种非临床小鼠肿瘤模型中，OX40的激动剂，包括抗体和OX40配体融合蛋白，已被成功地应用并具有有希望的结果(Kjaergaard等人，2000，癌症研究(CancerRes)，60：5514-21；恩德洛武(Ndhlovu)等人，2001，免疫学杂志(JImmunol)，167：2991-9；温伯格(Weinberg)等人，2000，免疫学杂志(JImmunol)，164：2160-9)。共刺激T细胞通过OX40促进抗肿瘤活性在一些情况下是持久的，针对随后的肿瘤挑战提供持久的保护(温伯格(Weinberg)等人，2000，免疫学杂志(JImmunol)，164：2160-9)。Treg细胞抑制和效应T细胞的共刺激被证明对于OX40激动剂的肿瘤生长抑制是必要的(Piconese等人，2008，实验医学杂志(JExpMed)，205：825-39)。通过与疫苗、化疗、放疗、和免疫疗法组合，已探索许多策略和技术以提高OX40激动剂治疗的抗肿瘤效果(延森(Jensen)等人，2010，肿瘤学研讨会(SeminOncol)，37：524-32；梅莱罗(Melero)等人，2013，临床癌症研究(ClinCancerRes)19：997-1008)。概述本披露涉及多肽亚基，每一个作为融合多肽都包括OX40配体(OX40L)的受体结合域、三聚结构域和人IgG4Fc结构域，这些多肽亚基能够形成稳定的多聚体(例如，六聚体蛋白)。提供的组合物和方法对于癌症免疫治疗是有用的。本披露提供一种单链多肽亚基，该单链多肽亚基包括：人IgG4Fc结构域；功能性三聚结构域；和OX40L的受体结合域。在某些方面中，所提供的多肽亚基可以自组装成三聚体或六聚体蛋白。在某些方面中，该多肽亚基包括(从氨基末端到羧基末端)人IgG4Fc结构域，随后是三聚结构域，随后是OX40L受体结合域。人IgG4Fc结构域的羧基末端可以直接融合到三聚结构域的氨基末端，且三聚结构域的羧基末端可以直接融合到OX40L受体结合域的氨基末端。在本披露提供的多肽亚基的进一步方面中，IgG4Fc结构域包括IgG4铰链区，其可以包括赋予完整的重链间二硫键形成的突变，例如，根据欧盟编号在位置228处丝氨酸至脯氨酸的突变(S228P)。在某些方面中，该铰链区包括SEQIDNO:4的氨基酸1至12。人IgG4Fc结构域还可以包括CH2区，和/或CH3区。在某些方面中，人IgG4Fc结构域包括SEQIDNO:4的氨基酸1至229。由本披露提供的三聚结构域可包括α-螺旋卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域、或它们的组合。例如，三聚结构域可起源于TRAF2；血小板反应蛋白1；母系蛋白(Matrilin)-4；CMP(母系蛋白-1)；HSF1；和吞饮受体(Cubilin)。在某些方面中，该三聚结构域包括人TRAF2三聚结构域。在某些方面中，TRAF2三聚结构域包括人TRAF2(SEQIDNO:2)的氨基酸310至349。在本披露提供的多肽亚基的另外方面中，OX40L受体结合域可以包括人OX40L(SEQIDNO:1)的氨基酸51至183。在某些方面中，由本披露提供的多肽亚基可以自组装成可以特异性结合于人OX40的六聚体融合蛋白。在某些方面中，该多肽亚基包括氨基酸序列SEQIDNO:4。如在此提供的多肽亚基可进一步包括相关的异源剂。在此提供的异源剂可以是通过肽键融合到该多肽亚基的异源多肽。异源多肽可融合(例如)至IgG4-Fc结构域的N-末端、至OX40L的受体结合域的C末端、在该IgG4-Fc结构域的C-末端和三聚结构域的N-末端之间，或在三聚结构域的C-末端和OX40L的受体结合域的N-末端之间。在某些方面中，异源剂可以化学地轭合于多肽亚基，并且可以是，例如细胞毒性分子、稳定剂、免疫应答调节剂、或可检测的药剂。在某些方面中，本披露提供了可被用作对照的多肽亚基。例如，本披露提供了多肽亚基，其中OX40L受体结合域包括人OX40L(SEQIDNO:1)的氨基酸51至183，除了在位置180处苯丙氨酸至丙氨酸的取代(F180A)之外。从这个多肽亚基自组装的六聚体融合蛋白不能够结合至人OX40。在某些方面中，这个对照多肽亚基包括氨基酸序列SEQIDNO:6。在某些方面中，本披露提供了包括三个如在此提供的多肽亚基的三聚体蛋白。本披露提供包括六个如上所述的多肽亚基的六聚体蛋白。在某些方面中，该六个多肽亚基每一个包括氨基酸序列SEQIDNO:4。典型的六聚体融合蛋白是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链多肽亚基，包括：人IgG4Fc结构域；功能性三聚结构域；和OX40L的受体结合域，其中该多肽亚基可自组装成三聚体或六聚体蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.29 US 62/004555;2015.02.04 US 62/1117961.一种单链多肽亚基，包括：人IgG4Fc结构域；功能性三聚结构域；和OX40L的受体结合域，其中该多肽亚基可自组装成三聚体或六聚体蛋白。2.如权利要求1所述的多肽亚基，该多肽亚基从氨基末端到羧基末端包括人IgG4Fc结构域，随后是三聚结构域，随后是OX40L受体结合域。3.如权利要求2所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域的羧基末端是直接融合到该三聚结构域的氨基末端，且该三聚结构域的羧基末端是直接融合到该OX40L受体结合域的氨基末端。4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽亚基，其中该IgG4Fc结构域包括IgG4铰链区。5.如权利要求4所述的多肽亚基，其中该铰链区包括赋予完整的重链间二硫键形成的突变。6.如权利要求5所述的多肽亚基，其中该突变包括根据EU编号的在位置228处的丝氨酸至脯氨酸突变(S228P)。7.如权利要求5或权利要求6所述的多肽亚基，其中该铰链区包括SEQIDNO:4的氨基酸1至12。8.如权利要求1至7中任一项所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域进一步包括CH2区。9.如权利要求1至8中任一项所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域进一步包括CH3区。10.如权利要求9所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域包括SEQIDNO:4的氨基酸1至229。11.如权利要求1至10中任一项所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括α-螺旋卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域、或它们的组合。12.如权利要求11所述的多肽亚基，其中该三聚结构域起源于TRAF2；血小板反应蛋白1；母系蛋白(Matrilin)-4；CMP(母系蛋白-1)；HSF1；或吞饮受体(Cubilin)。13.如权利要求12所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括人TRAF2(SEQIDNO:2)的氨基酸310至349。14.如权利要求1至13中任一项所述的多肽亚基，其中该OX40L受体结合域包括人OX40L(SEQIDNO:1)的氨基酸51至183。15.如权利要求14所述的多肽亚基，其中从六个该多肽亚基组装的六聚体蛋白可特异性地结合至人OX40。16.如权利要求1至15中任一项所述的多肽亚基，包括SEQIDNO:4的氨基酸序列。17.如权利要求1至16中任一项所述的多肽亚基，进一步包括相关联的异源剂。18.如权利要求17所述的多肽亚基，其中该异源剂是异源多肽并经由肽键融合到该多肽亚基。19.如权利要求18所述的多肽亚基，其中该异源多肽融合至该IgG4-Fc结构域的N-末端、融合至OX40L的受体结合域的C末端、融合至该IgG4-Fc结构域的C-末端和该三聚结构域的N-末端，或融合至该三聚结构域的C-末端和OX40L的受体结合域的N-末端。20.如权利要求17所述的多肽亚基，其中该异源剂以化学方式轭合至该多肽亚基。21.如权利要求17至20中任一项所述的多肽亚基，其中该异源剂包括细胞毒性分子、稳定剂、免疫应答调节剂、或可检测的药剂。22.一种三聚体蛋白，包括如权利要求1至21中任一项所述的三个多肽亚基。23.一种六聚体蛋白，包括如权利要求1至21中任一项所述的六个多肽亚基。24.如权利要求23所述的六聚体蛋白，其中该六个多肽亚基各自包括SEQIDNO:4的氨基酸序列。25.如权利要求24所述的六聚体蛋白，包括OX40LIgG4P融合蛋白。26.如权利要求23至25中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白特异性结合在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任意组合的活化的CD4+或CD8+T细胞上表达的OX40。27.如权利要求26所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白可特异性结合在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任意组合的初级活化的CD4+T细胞上表达的OX40。28.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，其中对于在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40的结合亲和力是约1.0pM至约8.0pM，如通过流式细胞术测量的。29.如权利要求28所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约3.6pM。30.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在约0.5至约3.0pM处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上20％受体占有率(EC20)，在约3.0至约10pM处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上50％受体占有率(EC50)，并且在约35至约70pM处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上90％受体占有率(EC90)，如通过流式细胞术测量的。31.如权利要求30所述的六聚体蛋白，其中EC20为约1.8pM，EC50为约6.6pM，并且EC90为约53pM。32.如权利要求26所述的六聚体蛋白，其中对于在过量表达OX40的尤尔卡特(Jurkat)细胞上表达的人OX40的结合亲和力是约1.0pM至约24pM，如通过流式细胞术测量的。33.如权利要求32所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约12pM。34.如权利要求26所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白质在过量表达OX40的尤尔卡特细胞上在约1.0至15pM处可实现EC20，在过量表达OX40的尤尔卡特细胞上在约1.0至40pM处可实现EC50，并且在过量表达OX40的尤尔卡特细胞上在约10至100pM处可实现EC90，如通过流式细胞术测量的。35.如权利要求34所述的六聚体蛋白，其中EC20为约7.2pM，EC50为约16pM，并且EC90为约57pM。36.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，其中对于在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40的结合亲和力是约1.0pM至约50pM，如通过流式细胞术测量的。37.如权利要求36所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约24pM。38.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，其中对于在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40的结合亲和力是约1.0pM至约50pM，如通过流式细胞术测量的。39.如权利要求38所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约21pM。40.如权利要求23至39中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在基于平板的试验中诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖并且诱导从活化的CD4+T细胞释放剂量依赖性细胞因子。41.如权利要求40所述的六聚体蛋白，其中在初级活化的人CD4+T细胞中在约1.0pM至约15pM的六聚体蛋白浓度处可实现20％最大增殖应答(EC20)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约5.0pM至约25pM的六聚体蛋白浓度处可实现50％最大增殖应答(EC50)，并且在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约65pM的六聚体蛋白浓度处可实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术测量的。42.如权利要求41所述的六聚体蛋白，其中EC20为约8.0pM，EC50为约14pM，并且EC90为约57pM。43.如权利要求40所述的六聚体蛋白，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它们的任意组合。44.如权利要求43所述的六聚体蛋白，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它们的任意组合。45.如权利要求23至39中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和在初级活化的恒河猴CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：M达姆施罗德，M奥伯斯特，S哈蒙德，H冯，
申请(专利权)人：免疫医疗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US