一种新型TRAIL融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提供了一种新型TRAIL融合蛋白，含有TGF‑α第三环区的序列，具有极强的特异性肿瘤杀伤作用；并公开了新型TRAIL融合蛋白的编码基因及其表达途径，融合蛋白的生产方法，以及该蛋白质在治疗肿瘤等疾病中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及新型TRAIL融合蛋白，以及利用基因工程技术生产该融合蛋白的方法以及其作为药物治疗肿瘤和其它相关疾病的应用。
技术介绍
TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)也称为Apo2L(Apo-2ligand,凋亡素-2配体)，是肿瘤坏死因子超家族的一个成员[1]，其正式命名为肿瘤坏死因子超家族成员10(Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10)。TRAIL分子由281个氨基酸残基组成，是一个典型的II型跨膜蛋白，18-38氨基酸残基形成具有螺旋结构的单次跨膜区，氨基端位于胞浆内，羧基段的39-281氨基酸残基位于细胞外。TRAIL胞外部分可以被蛋白酶切割，释放进入组织间液和血液中，形成可溶性的分子形式(sTRAIL)[2]。重组表达的一些人源sTRAIL片段，如对应于胞外95-281、104-281或114-281的TRAIL序列，都具有诱导细胞凋亡的活性；安进公司和罗氏公司合作开发的TRAIL(114-281)重组蛋白，称为杜拉乐明(Dulanermin)，已进入临床研究[3]。TRAIL作用于至少五个内源性的受体[4]。只有膜受体TRAIL-R1和TRAIL-R2含有胞内死亡结构域而能向细胞内传递死亡信号，因此，TRAIL只能通过激活这两个死亡受体(也分别称为DR4和DR5)诱导细胞凋亡。TRAIL只有形成同型三聚体，才具有受体激活活性。应用死亡受体TRAIL-R1和TRAIL-R2的激动性单克隆抗体，也能产生一样的生物效应[5,6]。TRAIL-R3、TRAIL-R4和可溶性受体OPG可能作为拮抗性受体调节TRAIL的活性。死亡受体激动剂具有抑制肿瘤的生理活性，并具有先天的肿瘤特异性和选择性，它们极可能成为更高效的肿瘤治疗药物。在大量临床前研究中，许多sTRAIL以及TRAIL-R1和TRAIL-R2的激动性单克隆抗体，展现了良好的抗肿瘤效果，但这些TRAIL受体激动剂在临床实验中，尽管毒性较低，有很高的安全性，在个别病人有持续的抗肿瘤作用，却没有获得确定的临床疗效[7-9]。常规的重组sTRAIL临床疗效不佳，可能归因于其药代动力学上有限的剂量暴露，如杜拉乐明的半衰期在人体少于1h。缺乏疗效也可能是由于TRAIL受体在许多正常细胞和组织的广泛表达，全身治疗时，大多数sTRAIL结合到正常组织中相对过剩的TRAIL受体上，sTRAIL对肿瘤细胞的吸附量下降，因而活性降低[10]。此外，由于拮抗性受体TRAIL-R3和TRAIL-R4在肿瘤中的广泛表达，sTRAIL对肿瘤细胞激动性死亡受体的结合进一步被限制，治疗效果受
到严重损害。TRAIL-R1和TRAIL-R2的激动性单克隆抗体，具有很好的药代动力学特征，对TRAIL受体的结合有很高的类型特异性，但在临床研究中也没有获得更好的疗效[11]。通过某些方法，提高TRAIL的活性，是增强其临床有效性的发展目标。如通过与白蛋白融合，可以明显提高TRAIL的血浆半衰期[12]；主要针对DR4和DR5的型特异性TRAIL突变体[13,14]，能够提高其对不同肿瘤细胞的杀伤效应；TRAIL可以与针对肿瘤标志物的抗体或其片段融合[15,16]，这种融合蛋白通过抗原靶向性，促使其对预定的细胞表面目标抗原结合，导致选择性肿瘤细胞聚集，并通过旁观者效应，即利用表面交联有TRAIL蛋白的细胞对缺乏抗原的邻近肿瘤细胞的杀伤作用，产生增强的药理活性[17]。但融合的靶向/效应域的分子可能干扰TRAIL的结构形成和生物活性[18]。EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)是受体酪氨酸激酶ErbB家族中的一个类型(ErbB1)，参与调控细胞生长、增殖、分化和迁移等多种重要的生物事件，在多种肿瘤细胞中过量表达。EGFR与相应配体EGF、TGF-α等结合，可以诱导受体自身二聚体化，同时由其胞内酪氨酸激酶结构域发生自身磷酸化而活化，激活下游一系列级联酶促信号传导过程，将生长信号传递至核内。EGFR是一个有确定意义的药物靶点[19]；抗EGFR的单克隆抗体，和特异性靶向EGFR酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂如吉非替尼(gefitinib)以及埃罗替尼(erlotinib)，可以有效地治疗一些EGFR阳性肿瘤的患者。抗EGFR药物抑制EGFR信号通路，能够增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性[20]。抗EGFR抗体与sTRAIL形成的重组融合蛋白，靶向EGFR阳性肿瘤细胞，既能迅速灭活EGFR介导的有丝分裂信号，又能有效地激活TRAIL受体，介导细胞凋亡信号转导，具有很强的抗肿瘤活性[21,22]。EGFR的天然配体EGF、TGF-α等或其有效结合片段，以及设计合成的人工肽片，与强效的细胞毒素通过融合重组或联结反应，能够生成靶向EGFR阳性肿瘤细胞的细胞毒素或免疫毒素[23-26]。这些联结/融合物与EGFR结合后进入细胞内，诱导细胞死亡，或通过免疫反应，杀伤肿瘤细胞。相比于抗体融合，配体融合或联结分子具有更小的分子质量和体积，易于向肿瘤组织内渗透，可能获得更稳定的疗效，也更利于生产制备。作为EGFR的天然配体的小分子量多肽TGF-α，与EGF有着相似的分子结构与功能；它们在肽链内部均存在3对二硫键，将约50个氨基酸长度的肽链折叠成三环结构。TGF-α第三环区(TGF3L)能结合EGFR，但不具有TGF-α和EGF的促细胞分裂增殖活性[27]。人TGF3L与TNFα融合形成的融合蛋白，对鼠肿瘤L929细胞具有与TNFα相同的毒性作用，而对两种人肿瘤细胞的细胞毒性明显高于原型TNFα[28]。人TGF3L与超抗原的N-端或C-端融合，均能增加其免疫治疗活性[24]。[1].Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ et al:Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity 1995,3(6):673-682.[2].Tecchio C,Huber V,Scapini P et al:IFNalpha-stimulated neutrophils and monocytes release a soluble form of TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL/Apo-2ligand)displaying apoptotic activity on leukemic cells.Blood 2004,103(10):3837-3844.[3].Holland PM:Targeting Apo2L/TRAIL receptors by soluble Apo2L/TRAIL.Cancer Lett 2013,332(2):156-162.[4].den Hollander MW,Gietema JA,de Jong S et本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中所述第一结构域是TGF‑α来源的多肽，而所述第二结构域是结合TRAIL受体的多肽。

【技术特征摘要】
2015.04.10 CN 20151016565631.包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中所述第一结构域是TGF-α来源的多肽，而所述第二结构域是结合TRAIL受体的多肽。2.权利要求1所述的融合蛋白，基本上由第一结构域和第二结构域组成，其中所述第一结构域为TGF-α的至少一部分，所述第二结构域为TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。3.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一结构域是人TGF-α，而所述第二结构域是人TRAIL。4.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一结构域为TGF-α第三环区，具有SEQ.ID.NO.3所示的氨基酸序列，所述第二结构域为TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。5.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是SEQ.ID.NO.8所示的氨基酸序列。6.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ.ID.NO.8具有至少95％...

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，闫征，王燕，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11