一种融合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术所述融合蛋白包括超正电荷绿色荧光蛋白和镧系离子结合肽，以超正电荷绿色荧光蛋白作为光学成像模体，结合了钆离子的镧系离子结合肽作为顺磁探针，制备过程不需要任何化学修饰，所得的融合蛋白生物兼容性较强，性质稳定，造影效果增强，是集荧光成像、磁共振成像、细胞穿透和被动肿瘤靶向于一体的多功能细胞内成像试剂，能够被动靶向活体动物的肿瘤组织，特异性的对肿瘤进行成像，而不需要修饰任何靶向模体，可以作为细胞内的成像试剂，对肿瘤细胞实现荧光和磁共振双成像。本发明专利技术所述融合蛋白的制备方法简单，成本低廉，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及，尤其是一 种可以用于细胞和组织的荧光和磁共振双成像的融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
现代科学的发展，使得人们对生命活动的本质研宄正迅速还原到细胞和亚细胞层 面。分子成像技术为实现细胞内各种小分子的检测和代谢途径的示踪提供了有力的工具。 成像技术，包括光学成像（OI)、磁共振成像（MRI)、正电子发射断层扫描（PET)和计算机断 层扫描（Cl)等，可以在分子水平上实现生物有机体生理和病理变化的实时动态无创伤的 三维成像，为研宄特定生物体生长发育、疾病发生发展和药物作用效果等提供有效的分析 手段。然而，由于在目前的各种分子成像模式中，还没有一个能够提供所有必要的信息以满 足临床的需要，因此，多种成像模态的融合成为目前医学和成像技术发展的趋势。同一探针 的多模态成像可以提供更快捷精确、高分辨的结构和功能信息，从而提高成像质量，并将极 大的推动生物医药领域的发展。 荧光成像（FI)主要包括生物发光和荧光两种成像技术。这种技术有很高的灵敏 度和实时成像能力，对肿瘤微小转移灶的检测能力极高。并且由于其操作简单安全，所得结 果直观等优点已被广泛应用于生物医学和药物开发的研宄当中。 磁共振成像（MRI)是根据核磁共振原理，利用人体组织中的氢原子核在外加梯度 磁场中受到激发而产生电磁波，从而绘制人体内部某一层面的结构图像。该技术所获得的 图像非常清晰精细，可以对人体各部位多角度成像，其分辨力高，对病灶能更好的定位定 性，尤其是对早期肿瘤的诊断有很大的价值。其中，细胞成像在肿瘤细胞的转移检测、癌组 织的手术切除方案设计中都有着重要的应用前景。然而目前所使用的MRI造影剂由于本身 性质无法进入细胞而只能分布在细胞质基质中，因此限制了其在细胞内成像中的应用。目 前已有科学家尝试将细胞跨膜肽连接在造影剂上以提高其进细胞的效率，但仍存在一些问 题，比如造影剂从细胞内渗漏逃逸以及弛豫率的淬灭，而复杂的化学合成也限制了这一方 法的应用。 荧光成像虽然有很高的灵敏度，但由于其较弱的穿透力，使得它只能应用于表面 或者近表面。而MRI有更好的空间分辨力，从而能够提供解剖的细节和高质量的软组织图 像，但它的灵敏度比荧光成像低。由于FI和MRI的优点和局限性高度互补，因此，将FI和 MRI两种成像技术结合在一个探针中，制备荧光和磁共振成像的双模式成像剂，能有效克服 现有方法的不足。 目前，常见的制备荧光和磁共振成像的双模式成像剂的方法主要是通过化学反应 的办法将两种成像模体连接起来。例如用化学方法将顺磁性离子和量子点结合，或用硅壳 包裹磁性核和荧光基团。然而，这些化学合成的方法通常比较复杂困难，针对每个不同的成 像模体要设计特定的反应流程，从而限制了其广泛的应用。而且通过化学方法制备出的探 针的生物兼容性很难预测，有些具有高毒性和潜在的污染危害，这就限制了这种方法在生 物和医学方面的应用。另外，量子点或者荧光染料易光漂白而失去荧光，稳定性较差。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种可以用于细胞和组织的荧光和磁共振双成 像的融合蛋白及其制备方法。 为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案： -种融合蛋白，包括超正电何绿色5^光蛋白和铜系尚子结合狀。 在一些实施方案中，所述超正电荷绿色荧光蛋白为 (1)表面带有36个正电荷的绿色荧光蛋白（GFP36+); (2)表面带有48个正电荷的绿色荧光蛋白（GFP48+); 或（3)在带有36个正电荷的绿色荧光蛋白或表面带有48个正电荷的绿色荧光蛋 白的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序 列。 在一些实施方案中，所述镧系结合肽为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的N次串 联，N为彡1的整数。 在一些实施方案中，所述超正电荷绿色荧光蛋白与所述镧系离子结合肽由连接子 连接，所述连接子的序列为（GGS) n，其中η为多3的整数。 进一步的，在一些优选实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:4-6所示的氨 基酸序列或在SEQ ID N0:4-6所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或几个氨基 酸获得的具有同等功能的氨基酸序列。 在一些实施方案中，所述融合蛋白经过修饰，所述修饰为在所述融合蛋白上添加 靶向肽、PEG包裹所述融合蛋白或在所述融合蛋白上偶联药物。 本专利技术还提供了编码本专利技术所述融合蛋白的DNA分子。 本专利技术还提供了一种重组DNA载体，含有本专利技术所述DNA分子。 本专利技术还提供了一种宿主细胞，含有本专利技术所述重组DNA载体。 本专利技术还提供了本专利技术所述融合蛋白的制备方法，包括： 步骤1 :获取编码超正电荷绿色荧光蛋白的DNA分子，获取编码连接子和镧系离子 结合肽的DNA分子； 步骤2 :将编码超正电荷绿色荧光蛋白的DNA分子与编码连接子和镧系离子结合 肽的DNA分子连接与表达载体融合，构建重组表达载体； 步骤3 :重组表达载体转化宿主细胞，诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合 蛋白，分离、纯化表达的融合蛋白。 进一步的，本专利技术还提供了所述融合蛋白在制备荧光和磁共振的双模式的成像剂 中的应用。 本专利技术所述融合蛋白包括超正电荷绿色荧光蛋白和镧系离子结合肽，本专利技术所述 融合蛋白利用较为安全的蛋白质作为载体，制备过程不需要任何化学修饰，生物兼容性较 强。本专利技术所述融合蛋白有效的保存了超正电荷绿色荧光蛋白和镧系离子结合肽两个成像 模体的性质，既不影响超正电荷荧光蛋白的荧光成像和细胞转导功能，也不影响镧系离子 结合肽的磁共振成像的性质，性质稳定。与小分子磁共振造影剂相比，本专利技术所述融合蛋白 分子量较大造影增强效果。 本专利技术所述融合蛋白通过蛋白重组表达技术制备得到，制备方法简单，不需要复 杂的标记和任何化学修饰步骤，成本低廉，适合工业化生产。在操作时无需避光，也不存在 放射等污染因素，操作简单便捷。 本专利技术所述融合蛋白是集荧光成像、磁共振成像、细胞穿透和被动肿瘤靶向于一 体的多功能细胞内成像试剂，能够被动靶向活体动物的肿瘤组织，特异性的对肿瘤进行成 像，而不需要修饰任何靶向模体，可以作为细胞内的成像试剂，对肿瘤细胞实现荧光和磁共 振双成像。【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 图1示实施例lpET21a-GFP36+-9L-dLBT载体示意图，其中，9L表示表达（GGS) i^ 基因序列，dLBT表示表达两个串联重复的镧系离子结合肽的基因序列； 图2示实施例7纯化后的GFP36+-9L-dLBT融合蛋白结合钆离子后的蛋白质 (Gd-GFP36+-9L-dLBT)的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，泳道1为蛋白分子量标记，泳道2为 GFP36+-9L-dLBT 融合蛋白，泳道 3 为 Gd-GFP36+-9L-dLBT 融合蛋白； 图3示实施例7电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)测定Gd-DTPA和 Gd-GFP36+-9L-dLBT融合蛋白中Gd3+的含量；其中，IZE3表示Gd-DTPA，^^·表示 Gd-GFP36+-9L-dLBT 融合蛋白； 图4示实施例7荧光光谱检测GFP36+蛋白与GF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，包括超正电荷绿色荧光蛋白和镧系离子结合肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴芩，刘扬中，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34