一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种抗胎盘样硫酸软骨素(pl‑CS)的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体主要包括抗pl‑CS的抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内区串联构成；其中，所述抗pl‑CS的抗原识别区为疟原虫蛋白VAR2CSA、疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段或pl‑CS抗体中的任意一种；所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段为疟原虫蛋白VAR2CSA中的氨基酸数量大于500的肽段。本发明专利技术表达此嵌合抗原受体的T细胞能最大程度的杀伤肿瘤细胞，少或无细胞因子释放，对正常组织的伤害程度很小，能突破肿瘤免疫抑制微环境，从而对实体瘤具有更好的疗效，且几乎能治疗各种类型的肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点pl-CS为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术是目前在进行大规模临床试验的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。其基本技术是通过基因工程手段，将T细胞改造成不依赖HLA的方式识别肿瘤抗原，使得CAR-T细胞相较于天然T细胞具有更强的识别和杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T的核心部件是CAR，CAR一般包括一个肿瘤相关抗原结合区，通常来源于肿瘤相关抗原的单克隆抗体scFV段；一个胞外铰链区；一个跨膜区和一个胞内刺激信号区。CAR-T技术成功的关键是肿瘤抗原即靶点的选择。理想的抗原是在肿瘤细胞表面高表达，在正常细胞不表达的抗原。只有选择这样的抗原，才会使CAR-T细胞专一的结合并杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞不结合，不会对正常组织造成伤害。但这样理想的抗原并不多，大多数抗原是在肿瘤组织中高表达或者过度表达，在正常组织中低表达。目前，CAR-T在实体肿瘤的治疗远不及白血病的治疗效果，其原因之一就是各实体瘤的中均没有找到非常理想的靶标。CAR-T技术用于治疗实体瘤的效果不好的另一个原因是肿瘤免疫抑制微环境的存在。肿瘤免疫抑制微环境是肿瘤发生发展过程中形成的内环境，由肿瘤细胞，间质细胞，免疫调节细胞，微血管，组织液，细胞因子，细胞外基质等组成。由于免疫微环境的存在，免疫杀伤细胞无法有效到达肿瘤细胞部位或者到达目标部位后无法对肿瘤细胞进行有效的杀伤。CAR-T细胞要对实体瘤进行有效的治疗，必需突破肿瘤免疫微环境限制，进入实体瘤实现对肿瘤细胞的杀伤。CN104788573A公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于表面CD19阳性的肿瘤的治疗。该专利的嵌合抗原受体只针对于表面CD19阳性的肿瘤，且识别效果不好，因此，筛选合适的肿瘤靶标，同时还能突破肿瘤微环境，是CAR-T技术治疗实体瘤的关键。硫酸软骨素(CS)是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺(又称N-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。硫酸软骨素存在于从线虫到人除植物外的所有生物中，发挥着许多重要的生理功能。虽然多糖的主链结构并不复杂，但就硫酸化程度、硫酸基和两种差异向异构糖醛酸在链内的分布来说，呈现高度的不均一性。硫酸软骨素的精细结构决定着功能的特异性和与多种蛋白质分子的相互作用。胎盘中存在着一种特殊的硫酸软骨素，其糖基化模式与常规的硫酸软骨素不同，疟原虫中存在一种名为VAR2CSA蛋白，可以特异的结合胎盘中的硫酸软骨素，而在肿瘤细胞的表面，存在着胎盘样硫酸软骨素(pl-CS)，因此，pl-CS是CAR-T技术治疗肿瘤的理想靶点。
技术实现思路
针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶点选择不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本专利技术提供一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体，可以更特异的识别肿瘤细胞，对肿瘤微环境具有更好的靶向性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体主要包括抗pl-CS的抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内区串联构成；其中，所述抗pl-CS的抗原识别区为疟原虫蛋白VAR2CSA、疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段或pl-CS抗体中的任意一种；所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段为疟原虫蛋白VAR2CSA中的氨基酸数量大于500的肽段。本专利技术中，所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段指的是疟原虫蛋白VAR2CSA中的氨基酸数量大于500的肽段，可以是疟原虫蛋白VAR2CSA中的任意500个氨基酸或是500个氨基酸以上的肽段都是可行的。本专利技术中，疟原虫蛋白VAR2CSA、疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段ID1-ID2a和pl-CS抗体均可以特异性结合pl-CS，pl-CS几乎存在于所有类型的肿瘤细胞表面，而正常细胞的表面不存在pl-CS；选择pl-CS为肿瘤的特异性靶点，以VAR2CSA作为CAR的识别结构域来识别肿瘤的pl-CS，通过VAR2CSA识别pl-CS的方式，可以使CAR-T细胞特异的识别肿瘤细胞，更容易靶向到肿瘤微环境，进入到肿瘤组织内部，而不会对正常的细胞和组织造成伤害；此外，pl-CS还是肿瘤细胞外基质的组成部分，是形成肿瘤微环境的物质基础，选择pl-CS为靶点，有利于CAR-T细胞突破肿瘤免疫抑制微环境。优选地，所述疟原虫蛋白VAR2CSA为疟原虫pf3D7的VAR2CSA蛋白和/或疟原虫pfFCR3的VAR2CSA蛋白。优选地，所述疟原虫pf3D7的VAR2CSA蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.3，核酸序列为SEQIDNO.4。优选地，所述疟原虫pfFCR3的VAR2CSA蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.5，核酸序列为SEQIDNO.6。优选地，所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段为ID1-ID2a，所述ID1-ID2a的氨基酸序列为SEQIDNO.7，核酸序列为SEQIDNO.8。本专利技术中，所述ID1-ID2a是这个部分肽段中，长度比较小，是效果最好的一段。优选地，所述铰链区为人CD8α铰链区。优选地，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列为SEQIDNO.9，核酸序列为SEQIDNO.10。优选地，所述跨膜区为人CD28跨膜区。优选地，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列为SEQIDNO.11，核酸序列为SEQIDNO.12。作为优选技术方案，所述胞内区为人CD3ζ胞内区、人CD28胞内区或人4-1BB胞内区中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是CD3ζ胞内区、人CD28胞内区、人4-1BB胞内区、人CD28胞内区与人CD3ζ胞内区的串联、人4-1BB胞内区与人CD3ζ胞内区的串联、人CD3ζ胞内区与人4-1BB胞内区的串联或人CD28胞内区、人4-1BB胞内区与人CD3ζ胞内区的串联，优选为CD3ζ胞内区、人CD28胞内区与人CD3ζ胞内区的串联、人4-1BB胞内区与人CD3ζ胞内区的串联或人CD28胞内区、人4-1BB胞内区与人CD3ζ胞内区的串联。优选地，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列为SEQIDNO.13，核酸序列为SEQIDNO.14。优选地，所述人CD28胞内区与人CD3ζ胞内区的串联的氨基酸序列为SEQIDNO.15，核酸序列为SEQIDNO.16。优选地，所述人4-1BB胞内区与人CD3ζ胞内区的串联的氨基酸序列为SEQIDNO.17，核酸序列为SEQIDNO.18。优选地，所述人CD28胞内区、人4-1BB胞内区本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体主要包括抗pl‑CS的抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内区串联构成；其中，所述抗pl‑CS的抗原识别区为疟原虫蛋白VAR2CSA、疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段或pl‑CS抗体中的任意一种；所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段为疟原虫蛋白VAR2CSA中的氨基酸数量大于500的肽段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.26 CN 2015108437209;2016.01.18 CN 201610031.一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体主要包括抗pl-CS的抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内区串联构成；其中，所述抗pl-CS的抗原识别区为疟原虫蛋白VAR2CSA、疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段或pl-CS抗体中的任意一种；所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段为疟原虫蛋白VAR2CSA中的氨基酸数量大于500的肽段。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述疟原虫蛋白VAR2CSA为疟原虫株pf3D7的VAR2CSA蛋白和/或疟原虫株pfFCR3的VAR2CSA蛋白；优选地，所述疟原虫株pf3D7的VAR2CSA蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.3，核酸序列为SEQIDNO.4；优选地，所述疟原虫株pfFCR3的VAR2CSA蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.5，核酸序列为SEQIDNO.6；优选地，所述疟原虫蛋白VAR2CSA的部分肽段为ID1-ID2a，所述ID1-ID2a的氨基酸序列为SEQIDNO.7，核酸序列为SEQIDNO.8。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为人CD8α铰链区；优选地，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列为SEQIDNO.9，核酸序列为SEQIDNO.10。4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为人CD28跨膜区；优选地，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列为SEQIDNO.11，核酸序列为SEQIDNO.12。5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内区为人CD3ζ胞内区、人CD28胞内区或人4-1BB胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD3ζ胞内区...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚永超，戚何妹，郭文中，秦莉，陈小平，
申请(专利权)人：广州中科蓝华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44