抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种抗原结合单元稳定的嵌合型抗原受体，其中包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、以及细胞内共刺激信号域，其中所述抗原结合单元相对于肿瘤特异性靶点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过由SEQ ID NO.2氨基酸序列编码的铰链相连接的重链以及轻链，本发明专利技术还涉及表达该受体的细胞及其应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及含有高稳定性的抗原结合单元的嵌合抗原受体，及其制备方法，含有 所述人工嵌合抗原受体的细胞，W及其应用。
技术介绍
过继免疫治疗采用的是未经基因修改的T细胞，并且已经在治疗某些癌症W及病 毒感染上展示其潜在的能力。例如通过供体淋己输入值LI)引发的移植物抗白血病效应 (GVL)用于复发性白血病的治疗W及通过注射体外扩增的肿瘤浸润性淋己细胞（TIL)结合 治疗前淋己细胞消除用于治疗晚期黑色素瘤。然后无论是DLI还是TIL治疗都具有严重的 副作用W及没有特异性而限制了其功效。现今已经尝试发现有效的免疫原性抗原用于对效 应T细胞的修改，其可W有选择性的针对白血病或者其他肿瘤。 T细胞过继免疫治疗是指将自体或者异体肿瘤激活的T细胞进行体外分离并且 扩增用于治疗肿瘤病人。它对于治疗转移性黑色素瘤具有卓越的成效，并且该反应W及在 50%的病人身上得到了客观的验证。 含有肿瘤特异性受体的肿瘤浸润淋己细胞是来源于一些肿瘤病人的，而过继T细 胞治疗则通过引入循环淋己细胞抗原而得到发展。为了做到该一天，基因编码的T细胞受 体可W来源于活动性高，肿瘤特异性T细胞或者来源于嵌合型抗原受体，它们包含了类似 于抗体的外部结构和细胞内T细胞信号域，例如CD3C，而该些可通过逆转录病毒W及慢病 毒进行引入。因为嵌合型抗原受体T细胞其对肿瘤细胞的攻击是不受MHC限制的，因此他 扩大了T细胞过继免疫治疗的应用。目前，多种CART相关的，用于淋己瘤，慢性淋己细胞白 血病，黑色素瘤W及成神经细胞瘤的临床治疗研究正在进行中。B细胞淋己瘤患者是一个很大的群体，其中慢性淋己细胞白血病患者会死 于该个疾病。而其中一个能够治疗该些病人的方法就是通过基因改造将能够针对 肿瘤细胞上特异性表达的抗原的嵌合型抗原受体表达在T细胞上。嵌合型抗原受 体（CAR)是一种设计出来不依赖于人类白细胞抗原并且可识别细胞膜表面抗原的 抗原受体。人们正在尝试利用该种表达CAR的基因改造的T细胞用于治疗一些类 型的病人炬rentjensetal., 2010,Molecular"Therapy, 18:4, 666-668;Morganet al. , 2010,MolecularTherapy,publishedonlineFeb.23, 2010,pages1-9 ;and,Tillet al.，2008,Blood, 112:2261-2271)。 在许多肿瘤中，肿瘤特异性抗原并没有被发现，但在B细胞淋己瘤中，CD19是 一个非常有潜力的肿瘤抗原。CD19仅表达于正常B细胞W及B细胞淋己瘤上，所W CD19是被广泛接受并且可W安全用于CART的抗原。虽然CARS触发T细胞激活的方 式与内源性T细胞受体激活的方式类似，但该技术用于临床应用的主要障碍是CART 细胞在体内的扩增，W及其注射后细胞的迅速消失和令人失望的临床活动（Jena,et al.，Blood, 2010, 116:1035-1044 ;化kun,etal.Blood, 1988, 71:13-29)。 在许多肿瘤中，肿瘤特异性抗原并没有被发现，但在B细胞淋己瘤中，得力于淋己 细胞消除的发展CART的临床结果也得到了提高，通过抗CD19的嵌合型抗原受体T细胞在B细胞淋己瘤的应用证明了W基因改造T细胞为基础的过继免疫治疗其在临床抗肿瘤的许 多问题得到了解决。但是，在该个治疗方案被广泛接受之前还是有许多没有解决的问题。 其中的一个问题就是单链可变区片段（scFv)作为一个融合蛋白在细胞膜表面表达的稳定 性。正如大家所知道的scFv作为抗体的单元是不稳定的，W及在早前研究中也发现CAR的 胞外部分的稳定性会影响T细胞的功能（gene化erapy, 6, 412)。由于CAR在肿瘤治疗使用 中其组分W及方法的稳定性将影响其功能，因对于其组分稳定性的研究W及方法的建立是 迫切需要的。本专利技术恰好解决了该一需要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗原结合单元（antigenbindingunit,Abu)稳定的嵌合型抗 原受体（CAR)，其包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、W及细胞内共刺激信号域，其中所 述抗原结合单元相对于肿瘤特异性祀点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过较链相连接 的重链W及轻链，所述较链由SEQIDNO. 2氨基酸序列编码。 其中，所述肿瘤特异性祀点为血液学恶性肿瘤相关抗原或实体瘤相关 抗原，更进一步的，所述肿瘤特异性祀点选自如下单一抗原或几个抗原的组合， CD19，CD20，EGFR or EGFRvIII，CEA，CD22，R0Rl，间皮素，CD33/IL3Ra，c-Met，PSMA,糖脂 巧7, GD-2, NY-ESO-ITCR, MAGE A3TCR。 其中，嵌合型抗原受体（CAR)针对肿瘤特异祀点CD19的稳定抗原结合单元的重链 由SEQIDNO. 1氨基酸序列编码，轻链由SEQIDNO. 3的氨基酸序列编码。 其中，嵌合型抗原受体（CAR)针对肿瘤特异祀点CD20的稳定抗原结合单元的重链 由SEQIDNO. 4的氨基酸序列编码，轻链由SEQIDNO. 5的氨基酸序列编码。 其中，嵌合型抗原受体（CAR)针对肿瘤特异祀点癌胚抗原CEA的稳定抗原结合单 元的重链由SEQIDNO. 6的氨基酸序列编码，轻链由SEQIDNO. 7的氨基酸序列编码。 其中，嵌合型抗原受体（CAR)针对肿瘤特异祀点EGFRvIII的稳定抗原结合单元的 重链由SEQIDNO. 8氨基酸序列编码，轻链由SEQIDNO. 9的氨基酸序列编码。 其中，跨膜结构域由SEQIDNO. 10氨基酸序列编码。 其中，所述细胞内共刺激信号域为融合CD3C信号域和CD28及CD137的细胞内结 构域的混合型细胞内共刺激信号域。 其中，所述CAR的共刺激信号域中包含了细胞内的混合型共刺激结构域，其选择 可W来源于CD27,CD28, 4-1BB，0X40,CD30,CD40,PD-1，IC0S，淋己细胞功能相关抗原-1(LF A-1)，CD2,CD7,LIGHT,NKG2C，B7-册，CD83的特异性配基W及其中的任意组合。 其中，其中，编码CAR中细胞内混合型信号域的氨基酸序列SEQ ID NO. 11中含有 SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13氨基酸序列。[001引其中，所述CD3C信号域由SEQIDNO. 14氨基酸序列编码，所述CD28的信号域由SEQIDNO. 12氨基酸序列编码，所述CD137的信号域由SEQIDNO. 13氨基酸序列编码。 其中，嵌合型抗原受体（CAR)的抗原结合单元由一个抗体或者一个抗原结合单元 组成，优选所述抗原结合单元是经过稳定性设计的单链抗体scFv。 本专利技术还提供一种制备表达所述CAR的细胞的方法，其包括如下步骤，（a)获得外 周血单核细胞（PBMCs) ;(b)转化或感染PBMC细胞，将编码CAR的表达框DM整合到细胞染 色体。 其中，表达所述CAR的细胞选自T细胞（细胞毒性T淋己细胞、调节性T细胞）， NK细胞，其中T细胞是自体、同种异体或异种T细胞。 本专利技术还提供了含有表达所述CAR的细胞在制备抗肿瘤相关药物中的用途。 其中，患者至少对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗原结合单元稳定的嵌合型抗原受体，其中包含胞外的抗原结合单元、跨膜结构域、以及细胞内共刺激信号域，其中所述抗原结合单元相对于肿瘤特异性靶点表达稳定，所述抗原结合单元包含通过铰链相连接的重链以及轻链，所述铰链由SEQ ID NO.2氨基酸序列编码。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李胜峰，秦超，丁雯，俞金泉，
申请(专利权)人：广州科锐特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44