一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用，使用本发明专利技术的方法可以快速构建针对不同肿瘤抗原的新一代CAR(嵌合抗原受体)载体。利用本发明专利技术制备的针对CD19分子的新一代CAR‑T细胞对CD19阳性肿瘤细胞显现出明显的杀伤效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用。
技术介绍
在国际上，一种新型的过继细胞免疫治疗技术异军突起，这就是应用嵌合抗原受体基因修饰的T细胞过继性地靶向性治疗肿瘤的研究，该研究在临床上取得了非常显著的进展。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)基因修饰的T淋巴细胞(以下简称CAR-T细胞)技术是一种非常有前景的新的ACI(基于T细胞的过继性细胞免疫治疗，adoptive cellular immunotherapy)，其突出特点是高度特异性、非组织相容性抗原(MHC)限制性及强烈而持久的杀瘤效应。多种肿瘤细胞表面表达特异性抗原，这也就为CAR-T细胞技术提供了良好的免疫治疗靶点。CAR的结构分为胞外抗原接合区、绞链区、跨膜区和胞内信号区，其抗肿瘤效应依赖于胞外抗原结合区的靶向性、绞链区的灵活性、胞内信号区供刺激分子及T细胞活化序列的协同作用。由于CAR的抗肿瘤效应受到多方面的限制，因此，本领域技术人员致力于开发新型的具有更强的杀伤效果的CAR-T技术，以用于肿瘤等疾病的治疗和预防。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体载体的方法及应用。本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体具有式Ia、或式Ib所述结构：A-B-C-D (Ia)，或A-C-B-D (Ib)，其中，A为Fc来源的多肽元件；B为CD28来源的多肽元件；C为CD137来源的多肽元件；D为CD3δ来源的多肽元件；“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。在另一优选例中，所述多肽元件A选自下组：(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:2中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件B选自下组：(A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件C选自下组：(A)具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件C的长度为30-50个氨基酸残基，优选为42个氨基酸。在另一优选例中，所述多肽元件D选自下组：(A)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:8所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件D的长度为80-120个氨基酸残基，优选为112个氨基酸残基。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。在另一优选例中，将所述嵌合抗原受体表达于T细胞时，所述T细胞具有以下特性：a)具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力；b)诱导杀伤性细胞因子产生的能力；c)对肿瘤细胞的杀伤不依赖于MHC的表达；和/或d)具有较长的体内存活时间。在另一优选例中，所述多肽元件A的外侧连接有单克隆抗体。在另一优选例中，所述单克隆抗体特异性的识别肿瘤标志性抗原。在另一优选例中，所述单克隆抗体为单链抗体(seFv)。在另一优选例中，所述单克隆抗体为抗CD19单克隆抗体。在另一优选例中，所述多肽元件A和所述单克隆抗体之间由肽接头连接，优选地，所述肽接头长度为2-5个氨基酸。本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的嵌合抗原受体。在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：(a)编码如SEQ ID NO.:10所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；(d)如(b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本专利技术第二方面所述
的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体选自：慢病毒载体、逆转录病毒载体、和睡美人表达系统。在另一优选例中，所述载体以cdh-cmv-ef1-copgfp慢病毒载体为骨架。本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本专利技术第一方面所述的嵌合抗原受体；和/或所述宿主细胞基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸；和/或所述宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体。在另一优选例中，所述宿主细胞为T细胞，或含有T细胞的细胞群。本专利技术的第五方面，提供了一种制备嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而制备出嵌合抗原受体修饰的T细胞。在另一优选例中，所述方法包括步骤：(1)构建慢病毒载体所述慢病毒载体包含式II所示的核苷酸序列：e-i IIi为编码本专利技术第一方面所述的CAR的核苷酸序列，e为编码抗体的核苷酸序列，e连接于多肽元件A的编码序列的外侧；(2)慢病毒包装将步骤(1)的慢病毒载体，用慢病毒包装系统和293T细胞进行慢病毒包装，收获病毒液，所述慢病毒包装系统包括质粒：Rev质粒、VSV-G质粒、和△R质粒；(3)T细胞转染将步骤(2)获得病毒液浓缩后转染T细胞，即获得所述嵌合抗原受体修饰的T细胞。在另一优选例中，所述抗体为单链抗体。在另一优选例中，所述单链抗体为特异性识别肿瘤抗原的抗体。在另一优选例中，所述抗原为CD19。在另一优选例中，e具有SEQ ID NO.:11所示的核苷酸序列。在另一优选例中，i具有SEQ ID NO.:9所示的核苷酸序列。本专利技术的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：本专利技术第一方面所述的嵌合抗原受体、本专利技术第二方面所述的多核苷酸、本专利技术第三方面所述的载体、或者本专利技术第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。本专利技术的第七方面，提供了本专利技术第一方面所述的嵌合抗原受体、本专利技术第二方面所述的分离的多核苷酸的用途，(1)用于制备治疗肿瘤的药物；和/或(2)用于制备嵌合抗原受体修饰的T细胞。在另一优选例中，所述的肿瘤选自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有式Ia、或式Ib所述结构：A‑B‑C‑D  (Ia)，或A‑C‑B‑D  (Ib)，其中，A为Fc来源的多肽元件；B为CD28来源的多肽元件；C为CD137来源的多肽元件；D为CD3δ来源的多肽元件；“‑”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有式Ia、或式Ib所述结构：A-B-C-D (Ia)，或A-C-B-D (Ib)，其中，A为Fc来源的多肽元件；B为CD28来源的多肽元件；C为CD137来源的多肽元件；D为CD3δ来源的多肽元件；“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述多肽元件A选自下组：(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:2中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或所述多肽元件B选自下组：(A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或所述多肽元件C选自下组：(A)具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或所述多肽元件D选自下组：(A)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:8所示氨基酸序列经过...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林，游凤涛，姜丽翠，
申请(专利权)人：博生吉医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32