本发明专利技术公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与F3肽的融合蛋白，F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。本发明专利技术还公开了一种如核苷酸序列以及包括它的重组载体、重组菌，还公开了前述变异体的制备方法和用途。本发明专利技术通过基因工程的方式制备得到了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其对肿瘤细胞的亲和力、诱导肿瘤细胞凋亡的能力、肿瘤靶向性和体内抗肿瘤活性均明显优于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，用于治疗肿瘤的疗效优良，临床应用前景良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途。
技术介绍
癌症是威胁人类生命的主要疾病之一。手术、放疗和化疗是目前癌症治疗的主要手段。能深入瘤内杀伤肿瘤细胞且对正常细胞损伤较小的药物是理想的化疗药物。然而大多数传统的化疗药物对细胞的杀伤缺乏选择性。随着对肿瘤发生、发展分子机制的深入了解和肿瘤标志物的发现，靶向性治疗药物已成为肿瘤化疗药物发展的新趋势(Nero TL et al.Nat Rev Cancer.2014,14:248–62；Goel HL et al.Nat Rev Cancer.2013,13:871-82)。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子TNF(Tumor Necrosis Factor)超家族成员。全长分子由281个氨基酸组成，包含N末端疏水跨膜区和暴露于胞膜外的C末端亲水区。TRAIL有四种膜结合型受体分子(TRAIL R1，R2，R3和R4)和一种可溶性受体分子(OPG)。这些受体中，只有TRAIL R1和R2是死亡受体(Death Receptor，DR)，在细胞膜表面与TRAIL结合后即被活化，通过胞内死亡信号结构域招募系列信号分子，传递死亡信号诱导细胞凋亡。而TRAIL R3和R4两种受体都是诱骗受体(Decoy Receptor，DcR)，分子内缺乏死亡信号传递结构域或该结构域不完整，与TRAIL结合后不传递死亡信号，不诱导细胞凋亡。死亡受体TRAIL R1和R2高表达于肿瘤细胞，而诱骗受体R3和R4在正常细胞高表达。因此，TRAIL能诱导肿瘤细胞凋亡却不伤害正常细胞，对肿瘤细胞的杀伤具有选择性(Gonzalvez F et al.Oncogene.2010,29:4752–65)。体内外研究发现，利用基因工程生产的人可溶性TRAIL在体外和动物模型中对乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、骨肉瘤、软骨瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、血液肿瘤和肿瘤内皮细胞等都表现强烈的杀伤作用(Stucke DW et al.Trends Mol Med.2013,19(11):685-94；Wilson NS et al.Cancer Cell.2012,22(1):80-90)。基因工程重组的人可溶性TRAIL作为抗肿瘤药物已进入临床I-II期试验。结果表明，TRAIL具有良好的安全性，多种肿瘤病人对TRAIL的治疗都有反应，极有可能被开发为新型抗肿瘤药物(Subbiah V et al.Mol Cancer Ther.2012，11(11)：2541-6.Soria JC et al.J Clin Oncol.2011，29(33)：4442-51)。但是，现有基因工程重组的可溶性TRAIL抗肿瘤效果还不理想,主要原因在于其受体分布广泛，对肿瘤的靶向性不强。针对这一缺陷，采用能特异结合肿瘤细胞的单链抗体或者肿瘤导向肽与TRAIL连接，可能增强TRAIL的肿瘤靶向性，进而改善其体内抗肿瘤效果。F3肽是由人高迁移率族核小体结合蛋白2(high mobility group nucleosomal binding protein 2)17-48位氨基酸组成，其能够特异性结合肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞(Porkka K et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2002，99(11)：7444-9)，能增强某些抗肿瘤药物的靶向性，但未见用其增强TRAIL肿瘤靶向性进而提高其抗肿瘤活性的报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，即TRAIL变异体，及其制备方法和用途。本专利技术肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，它是包含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和F3肽的融合蛋白。F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其中，所述F3肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。优选地，所述F3肽由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码。其中，所述连接子由2-20个氨基酸组成。优选地，所述连接子是(G4S)3连接子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体由SEQ ID NO：7或9所示的核苷酸序列编码。所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或10所示。本专利技术核苷酸序列，它包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列与F3肽的编码序列，二者之间通过连接子的编码序列连接。其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列如SEQ ID NO：1所示。其中，所述F3肽的编码序列如SEQ ID NO：3所示。其中，所述连接子是(G4S)3连接子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。所述核苷酸序列如SEQ ID NO：7或9所示。本专利技术还提供了包含前述核苷酸序列的重组载体或重组菌。本专利技术制备前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的方法，它是以前述核苷酸序列为目标片段，采用基因工程的方法制备得到的。本专利技术还提供了前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗细胞增生性疾病的药物中的用途。其中，所述治疗细胞增生性疾病的药物是治疗肿瘤或自身免疫性疾病的药物。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，它是以前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。目前，通过在抗肿瘤蛋白上添加导向肽、增强肿瘤靶向性是本领域提高蛋白药物抗肿瘤活性的方法之一。其中的关键问题在于，导向肽与蛋白药物连接在一起形成了新蛋白。新添加的导向肽与原有蛋白药物间可能相互影响而不能充分发挥各自原来的功能。因此，新蛋白不一定比原来的蛋白活性更强。目前的肿瘤导向肽众多，如RGD家族、NGR家族的肿瘤导向肽等。添加哪种导向肽，如何添加，能够最终制备得到一种抗肿瘤活性更强的新蛋白并不确定。比如，Bieker等(Blood 2009；113:5019-5027)利用一种L-NGR导向肽(GNGRAHA)与组织因子连接，增强了其抗肿瘤活性。但本专利技术人将L-NGR导向肽添加到TRAIL N-末端，获得的新蛋白抗肿瘤活性与TRAIL相比没有得到增强。这充分说明了利用肿瘤导向肽提高蛋白药物抗肿瘤活性的不确定性。然而，本专利技术以F3肽为靶向肽，并对其核苷酸序列进行了优化以后，与TRAIL融合制备的融合蛋白，具有良好的肿瘤靶向性和选择杀伤肿瘤的活性，体内外实验均证明其抗肿瘤活性优于TRAIL，尤其是对TRAIL抗性肿瘤，取得了意料不到的技术效果。本专利技术通过基因工程的方式，制备得到了纯品TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-C和TRAIL-F3-N，它们对肿瘤细胞的杀伤活性明显高于TRAIL，其中，TRAIL变异体蛋白TRAIL-F3-N对肿瘤细胞的亲和力、稳定性、诱导肿瘤细胞的凋亡的能力、肿瘤靶向性和体内抗肿瘤活性均明显优于TRAIL，用于治疗肿瘤的疗效优良；更进一步地，TRAIL变异体蛋白T本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与F3肽的融合蛋白，F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与F3肽的融合蛋白，F3肽通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。2.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述F3肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。4.根据权利要求3所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述F3肽由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码。5.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述连接子由2～20个氨基酸组成。6.根据权利要求5所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述连接子是(G4S)3连接子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。7.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：其由SEQ ID NO：7或9所示的核苷酸序列编码。8.根据权利要求6所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：8或10所示。9.一种核苷酸序列，其特征在于：它包括肿瘤坏死因...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢晓风，杨浩，万琳，程惊秋，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51
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