一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法及其产品技术

本发明专利技术提供了一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其中包括如下特征：整合素相关蛋白(CD47)和转录共激活因子(TAZ)两者均在乳腺癌组织中高表达，尤其在乳腺癌干细胞中表达特异升高；通过建立的CD47和TAZ过表达乳腺癌细胞，其表现出更强的增殖和转移能力以及肿瘤干细胞特征；本发明专利技术靶向该两者乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，因而构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，激活第一信号和共刺激信号而引发抗乳腺癌毒性活性，在体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其中包括如下特征：乳腺癌组织和乳腺癌干细胞特异性高表达整合素相关蛋白(CD47)和转录共激活因子(TAZ)，构建的CD47和TAZ过表达乳腺癌细胞表现出更强的增殖、转移能力以及肿瘤干细胞特征；本专利技术靶向乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，获得与两者特异结合的单链抗体，构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因(double chimeric antigen receptor，Di-CAR)，重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，在体内体外试验激活免疫信号而引发强大的抗乳腺癌毒性；本专利技术还提供了一种含通过上述方法而得到的自体T淋巴细胞制备的试剂盒，可用于制备靶向乳腺癌杀伤的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞。
技术介绍
淋巴细胞免疫技术在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，并取得一些临床疗效，主要包括细胞因子诱导杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞和浸润性T淋巴细胞等，但其为非特异性免疫作用，由于肿瘤细胞本身免疫逃逸和抗原隐蔽性，其对体内肿瘤细胞清除还非常有限。嵌合抗原受体基因修饰淋巴细胞技术的出现为临床治疗癌症提供了新的方向，其技术在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶性肿瘤细胞的目的，因而该技术给癌症临床治疗提供更好的应用平台。但是由于在实体瘤方面肿瘤抗原发现有限，而且很多肿瘤抗原除了在肿瘤细胞本身表达，也在正常组织中表达，因而无法对肿瘤细胞产生很好的特异性，杀伤肿瘤细胞同时也损伤了正常组织和器官，找到具有特异性的肿瘤抗原是该技术应用的关键。本专利技术提供了在乳腺癌组织和乳腺癌干细胞特异性高表达整合素相关蛋白(CD47)和转录共激活因子(TAZ)，CD47和TAZ过表达乳腺癌细胞表现出更强的增殖、转移能力以及肿瘤干细胞特征，以结合肿瘤细胞特异表达的CD47和TAZ的双特异嵌合抗原基因重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47和TAZ的乳腺癌细胞，特别是乳腺癌干细胞；激活第一信号和共刺激信号而体内体外引发抗乳腺癌细胞毒性活性，将有效地清除体内恶性肿瘤细胞和延长患者生存期。
技术实现思路
本专利技术针对现有临床应用T淋巴细胞技术靶向肿瘤细胞杀伤特异性差；以及在体内激活患者自身免疫作用抗肿瘤不足，特别对具有高耐药性、自我更新和成瘤性等的乳腺癌干细胞无杀伤作用，造成大多数恶性肿瘤临床治疗有限。本专利技术在前期研究工作中发现乳腺癌组织、乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞均特异表达的两个肿瘤抗原CD47和TAZ。同时我们通过构建的CD47和TAZ过表达慢病毒载体，包装成病毒后转染乳腺癌细胞，发现其具有更强的增殖和转移能力，并表现出肿瘤干细胞表型，和体内成瘤实验具有肿瘤干细胞特征。本专利技术根据该两个肿瘤抗原CD47和TAZ的胞外区通过杂交瘤技术获得与两者特异性结合反应的单克隆细胞株和单克隆抗体，蛋白测序确定单克隆抗体的重链和轻链的可变区，利用基因PCR技术将重链和轻链通过链接子(linker)连接产生单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，在酶联免疫法和细胞流式检测该两个scFv能特异结合CD47和TAZ两个肿瘤抗原，这两个scFv可以作为结合CD47和TAZ两个肿瘤抗原的抗体。本申请专利技术人利用DNA修饰酶-1011易位甲基胞嘧啶双加氧酶2(teneleven translocation methylcytosine dioxygenase 2，TET2)可抑制介素6(interleukin 6，IL-6)转录表达，我们发现将TET2在T淋巴细胞中高表达可抑制IL-6基因表达和分泌，从而阻止了T淋巴细胞分泌IL-6而产生的“免疫因子风暴”。因而我们根据这些科研结果，构建成含特异结合CD47以及TAZ的双特异嵌合抗原受体基因，并引入TET2以及CD28、CD137和CD3ζ胞内信号区的基因片段，重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性。本专利技术涉及一种靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，CD47和TAZ两者均在乳腺癌组织中高表达，尤其在乳腺癌干细胞中表达特异升高；通过建立的CD47和TAZ过表达乳腺癌细胞，其表现出更强的增殖和转移能力以及肿瘤干细胞特征；本专利技术靶向该两者乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，因而构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，激活第一信号和共刺激信号而引发抗乳腺癌毒性活性，在体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤活性。所述双特异性嵌合抗原受体(Di-CAR)基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染T淋巴细胞，再将T淋巴细胞培养到第14天，获得Di-CAR-T细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di-CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；所获得的T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；其高表达其特异标志物CD3+/CD8+，阳性率高于90％以上，而调节性T淋巴细胞CD4+/CD25+/Foxp3+阳性率低于5％以下。本专利技术所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌组织中高表达，通过荧光定量PCR检测，与正常乳腺组织相比，两者在乳腺癌组织中表达分别为89.00和134.55倍；蛋白印迹分析检测，两者在乳腺癌组织中表达分别为正常乳腺组织的23.49和35.67倍。优选地，所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌干细胞中高表达，体外培养获得的CD44+CD24-乳腺癌干细胞荧光定量PCR检测，与乳腺癌细胞相比，两者在乳腺癌组织中表达分别为23.45和54.33倍；蛋白印迹分析检测，两者在乳腺癌干细胞中表达分别为乳腺癌细胞的11.56和25.61倍。本专利技术还通过构建CD47和TAZ两个慢病毒载体，分别包装后转染乳腺癌细胞，其高表达CD47和TAZ基因与蛋白；体外细胞增殖培养分析，该两种CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞在第7天增殖倍数分别为未转染的乳腺癌细胞增殖的9.44和12.56倍；Transwell细胞迁移实验中，该两种细胞发生了明显的迁移，而未转染的乳腺癌细胞迁移不明显。而且CD47和TAZ两个慢病毒转染的乳腺癌细胞通过流式细胞仪检测，发现两者表达CD44+CD24-表型明显高于未转染的乳腺癌细胞，即该两种乳腺癌细胞的CD44+CD24-阳性率分别为67.56％和78.90％，而未转染的乳腺癌细胞仅为1.45％。裸鼠体内成瘤实验中，仅100个CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞接种时，在第7天就形成肿瘤，而未转染的乳腺癌细胞接种106数量级时方形成肿瘤，表明高表达了CD4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，靶向乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因(double chimeric antigen receptor，Di‑CAR)，重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞；所述双特异性嵌合抗原受体(Di‑CAR)基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染T淋巴细胞，再将T淋巴细胞培养到第14天，获得Di‑CAR‑T细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di‑CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di‑CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；所获得的T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；其高表达其特异标志物CD3+/CD8+，阳性率高于90％以上，而调节性T淋巴细胞CD4+/CD25+/Foxp3+阳性率低于5％以下。...

【技术特征摘要】
1.一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，靶向乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因(double chimeric antigen receptor，Di-CAR)，重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞；所述双特异性嵌合抗原受体(Di-CAR)基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染T淋巴细胞，再将T淋巴细胞培养到第14天，获得Di-CAR-T细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di-CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；所获得的T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；其高表达其特异标志物CD3+/CD8+，阳性率高于90％以上，而调节性T淋巴细胞CD4+/CD25+/Foxp3+阳性率低于5％以下。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将人IFNγ-信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD 137-CD3ζ胞内区，以及scFv(TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA，即Di-CAR；所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌组织中高表达，通过荧光定量PCR检测，与正常乳腺组织相比，两者在乳腺癌组织中表达分别为89.00和134.55倍；蛋白印迹分析检测，两者在乳腺癌组织中表达分别为正常乳腺组织的23.49和35.67倍。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌干细胞中高表达，体外培养获得的CD44+CD24-乳腺癌干细胞荧光定量PCR检测，与乳腺癌细胞相比，两者在乳腺癌干细胞中表达分别为23.45和54.33倍；蛋白印迹分析检测，两者在乳腺癌干细胞中表达分别为乳腺癌细胞的11.56和25.61倍。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，通过构建CD47和TAZ两个慢病毒载体，分别包装后转染乳腺癌细胞，其高表达CD47和TAZ基因与蛋白；体外细胞增殖培养分析，该两种CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞在第7天增殖倍数分别为未转染的乳腺癌细胞增殖的9.44和12.56倍；Transwell细胞迁移实验中，该两种细胞发生了明显的迁移，而未转染的乳腺癌细胞迁移不明显。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，CD47和TAZ两个慢病毒转染的乳腺癌细胞通过流式细胞仪检测，发现两者表达CD44+CD24-表型明显高于未转染的乳腺癌细胞，即该两种乳腺癌细胞的CD44+CD24-阳性率分别为67.56％和78.90％，而未转染的乳腺癌细胞仅为1.45％；裸鼠体内成瘤实验中，仅100个CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞接种时，在第7天就形成肿瘤，而未转染的乳腺癌细胞接种106数量级时方形成肿瘤，表明高表达了CD47和TAZ的乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞的表型和特性。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的双特异性嵌合抗原受体含有CD47和TAZ嵌合抗原受体基因，包括CD47的单链抗体并链接了特异结合IL-6基因转录抑制剂DNA修饰酶的基因片段，可抑制IL-6基因的表达；特异结合TAZ的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域和CD3ζ胞内信号区的基因片段；所述两个共刺激分子为CD28和CD137；双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞内蛋白翻译后可产生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，采集来源于乳腺癌患者自体外周血50-100ml，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用无血清培养基重悬并稀释到2-5×106细胞/ml，并补充1-500ng/ml IL-1α、10-2000IU/ml IL-2和5％自体血清，取10ml加入到鼠抗人CD3(OKT3)包被的75cm2培养瓶中，于37℃、含5％CO2培养箱培养到第3天；第3天离心收获T淋巴细胞，并通过苔盼兰计数；第3天收获的T淋巴细胞用无血清培养基重悬为5-10×106细胞/ml，取6ml加入到OKT3包被的75cm2培养瓶中，并加入100μl 1E+7 TU/ml重组Di-CAR慢病毒，体系为6ml，混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换无血清培养基10ml，所述完全培养液优选含1-500ng/ml IL-1α、10-2000IU/ml IL-2和5％自体血清；当T淋巴细胞生长密度达到10×106细胞/ml时，转入新的75cm2培养瓶中生长，并补充完全无血清培养液到50ml培养体系；于37℃、含5％CO2培养箱内培养到第14天，期间根据T淋巴细胞密度和培养基颜色变化补充含10-2000IU/ml IL-2和5％自体血清新鲜完全无血清培养液，或扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到1-3L培养袋中生长；培养到第14天的T淋巴细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di-CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；蛋白印迹技术检测其Di-CAR融合蛋白表达水平，可表达scFv(CD47)-CAR 53kDa和scFv(TAZ)-CAR 42kDa的融合蛋白。8.一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，将人IFNγ-信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锦杰，宋现让，
申请(专利权)人：江苏杰晟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32