一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR‑Cas9技术的基因编辑系统及其应用，以内源U6启动子依赖型载体系统为基础，在表达载体的Cas9表达盒内加入负筛选标记，并将包含同源臂的拯救载体上的抗药筛选标记转移至表达载体上，减少拯救载体的基础大小，扩大其容量，可介导在人疟原虫中敲入长达6.3kb外源基因片段，且获得的重组疟原虫不含抗药筛选标记和Cas9蛋白表达质粒的残留，可用同一药筛标记进行连续基因编辑，性能稳定，高效简洁，功能强大，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A gene editing system based on crispr-cas9 technology and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用。
技术介绍
基因编辑是利用人工核酸酶或“分子剪刀”对DNA进行插入、删除或替换的技术，包括第一代的ZFN锌指核酸酶技术，第二代的TALEN技术以及第三代的CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9技术具有设计简单、位点多、效率高、特异性好、耗时短等优点，是目前最热的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统主要元件有靶向靶基因的sgRNA(singleguideRNA)和Cas9核酸酶。该系统的作用原理为Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，在靶基因的特异位点进行切割，产生缺口。缺口产生后，细胞可以通过多种方式进行修复，主要包括经典的非同源末端(classicalnon-homologousendjoining，NHEJ)修复和同源重组(homologousrecombination，HR)修复等。在没有模板的条件下，往往发生NHEJ修复，该修复过程会产生DNA的插入或缺失，造成移码突变，导致基因失本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统，其特征在于，所述系统为内源U6启动子依赖型，包括表达载体和拯救载体；/n所述表达载体包括抗药筛选标记、sgRNA表达盒和Cas9表达盒，所述Cas9表达盒包括负筛标记；/n所述拯救载体包括同源臂插入位点和外源基因片段插入位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统，其特征在于，所述系统为内源U6启动子依赖型，包括表达载体和拯救载体；
所述表达载体包括抗药筛选标记、sgRNA表达盒和Cas9表达盒，所述Cas9表达盒包括负筛标记；
所述拯救载体包括同源臂插入位点和外源基因片段插入位点。


2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗药筛选标记包括HDHFR、BSD、NEO、PAC或YDHODH中的任意一种或至少两种的组合，优选为BSD；
优选地，所述负筛选标记包括yFCU和/或HSV-TK，优选为yFCU。


3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1或2所述的系统；
优选地，所述宿主细胞包括恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的中任意一种或至少两种的组合，优选为恶性疟原虫。


4.一种疟原虫基因编辑的方法，采用如权利要求1或2所述的系统，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建权利要求1或2所述的表达载体和拯救载体；
(2)根据目的基因筛选靶点序列并连接至表达载体中；
(3)将外源基因和来源于目的基因的同源臂克隆至拯救载体上；
(4)将步骤(2)的表达载体和步骤(3)的拯救载体制备成DNA-loadedRBC；
(5)将疟原虫裂殖体加入步骤(4)制备的DNA-loadedRBC中；
(6)进行抗药筛选和负筛，获得重组疟原虫；
(7)对步骤(6)获得的重组疟原虫进行单克隆化，将不同单克隆进行表达载体残留检测和药物敏感性测试；
(8)按照步骤(1)-(6)的操作方法，使用同一药筛标记对疟原虫进行再次基因编辑。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述疟原虫包括恶性疟原虫虫株Pf3D7、PfNF54、PfFCR3或PfDd2中的任意一种或至少两种的组合，优选为Pf3D7；
优选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：童英，卢俊南，张明虹，陈立志，梁兴祥，姚永超，秦莉，陈小平，
申请(专利权)人：广州中科蓝华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44