一种减毒系统及其应用技术方案

本发明专利技术具体涉及一种减毒系统及其应用，尤其涉及一种减毒及其用于疟原虫减毒的应用，具体为一种EF1g基因用于疟原虫减毒的用途。所述减毒系统通过采用调控系统来调控EF1g基因的表达或降解，从而控制疟原虫的生长，实现疟原虫的减毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种减毒系统及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种减毒系统及其应用，尤其涉及一种减毒及其用于疟原虫减毒的应用。
技术介绍
疟疾与艾滋病以及结核病并列世界三大传染病，疟疾是一种由单细胞原生动物疟原虫引起的，并由按蚊传播的传染疾病，寄生人体的疟原虫分为4种：恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariea)、间日疟原虫(P.vivax)以及卵形疟原虫(P.ovale)。95％的疟疾死亡是由恶性疟原虫感染导致，其主要分布在撒哈拉沙漠以南的非洲区域。目前，用于疟疾研究的动物模型主要为鼠疟及猴疟模型。鼠疟原虫可分为夏氏疟原虫(P.chaubdi)、伯氏疟原虫(P.berghei)、约氏疟原虫(P.yoelii)及文氏疟原虫(P.vinckei)等。而猴疟原虫主要为诺氏疟原虫(P.knowlesi)以及石蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)。人疟原虫有人和按蚊两个宿主，会在人体内进行无性繁殖和按蚊体内进行有性生殖。在人体内经历肝期和红内期两个阶段，肝期进行分裂生殖形成裂殖子，红内期会进行分裂增殖，同时有部分形成配子体，配子体可以进行有性生殖。成熟的疟原虫子孢子位于按蚊的唾液腺，按蚊叮咬人体的同时将子孢子注入人体血液。通过血液循环，几分钟内，子孢子侵入肝脏细胞，并在肝脏细胞中进行分裂增殖，经过十到十二天的发育成熟后，裂殖体涨破肝细胞，释放裂殖子进入血液。一部分裂殖子继续感染肝细胞，一部分侵入红细胞，进入红内期，剩下的大部分被吞噬细胞吞噬。侵入红细胞的裂殖子继续发育，经历环状体、大滋养体、未成熟裂殖体和成熟裂殖体阶段，成熟的裂殖体溢出红细胞。这个阶段的裂殖体不会入侵肝脏，部分裂殖体能够继续侵染红细胞，部分经过几次分裂增殖后不再分裂，继续发育形成雌或雄配子体。疟疾病人体内含有大量的疟原虫配子体，当按蚊叮咬时，成熟的雌雄配子体进入蚊胃，开始有性生殖。雌雄配子体进一步发育成为雌雄配子，雌雄配子融合形成合子，进一步发育成动合子，动合子入侵按蚊的胃壁，形成卵囊，随后进行无性生殖的孢子增殖阶段。孢子增殖形成大量游离于卵囊子孢子，子孢子移动到按蚊唾液腺中，进入下一循环。根据世界卫生组织2016年12月公布的最新估算数据，2015年有2.12亿起疟疾病例，42.9万人死亡。在2015年的统计数据中发现，全世界约有一半的人口面临疟疾的威胁，疟疾主要发生在撒哈拉以及南非，另外在东南亚、拉丁美洲以及中东地区也有不同程度的威胁。在2015年的疟疾统计中发现全球依然有91个国家以及地区有持续性的疟疾流行，撒哈拉以南非洲地区疟疾病例占全球疟疾病例总数的90％，并占了疟疾死亡总数的92％。同时在这些疟疾的高传播地区，5岁以下的儿童很容易感染疟疾而得病，严重的甚至会导致死亡。超过70％的疟疾死亡病例都是发生在5岁以下的儿童中，每两分钟就有一名儿童死于疟疾，所以疟疾是5岁以下儿童的头号杀手。除了5岁以下儿童，婴儿，孕妇以及艾滋病人等低免疫力人群都是疟疾的高风险人群。因此一种高效的疟疾疫苗对于保护人类，消除疟疾有很重大的意义。可是目前因为疟原虫的生活史复杂，抗原的成分多变，疫苗研究的实验模型不完善等原因，疫苗研发的进展不大。目前疟疾疫苗主要分为：1、红前期疫苗，如RTS，诱导针对环子孢子蛋白的抗体，具有比较好的临床保护效果，但是保护力较低，只有25-50％。而其它红前期的亚单位蛋白疫苗、DNA疫苗都没有明显的保护效果；2、红内期疫苗，是利用裂殖子表面抗原、侵入红细胞相关抗原以及感染的红细胞表面抗原开发的疫苗，目前针对MSP1以及AMA1开发的红内期亚单位疫苗都没有明显的保护效果；3、传播阻断疫苗，利用配子体或合子体表面抗原阻止配子的结合或合子的发育从而阻断疟疾传播的疫苗，但是目前的传播阻断疫苗引起的抗体水平不高所以不具有实用价值；4、多阶段多抗原疫苗，一种复合的抗原，如SP66，包含红内期抗原MSP1肽以及环子孢子蛋白CSP中间复制区，目前的临床实验显示没有保护效果；5、全虫疫苗，一种减毒的疟原虫活疫苗，包括放射减毒疫苗，基因减毒疫苗以及药物减毒疫苗。放射减毒疫苗通过辐照感染疟原虫的按蚊，令子孢子DNA突变，不能进入红内期以实现减毒。利用辐照减毒的恶性疟原虫以及间日疟原虫获得的子孢子疫苗有保护作用，但是保护力较低，另外因为辐照减毒并不可控，不能保证安全性，限制了辐照减毒疫苗的应用。药物减毒疫苗利用野生型的疟原虫感染宿主，同时给宿主抗疟药杀死疟原虫从而获得免疫。早期的实验验证了通过感染了恶性疟原虫的按蚊叮咬志愿者后给以口服氯喹治疗控制红内期的感染可以诱导完全的保护作用，但是在接种疟原虫后如不按时服用抗疟药会引起原虫血症，引起不良反应，被按蚊叮咬后可能引发疟疾传播，具有较大风险，制约了减毒疫苗的应用。基因减毒疫苗目前主要是通过敲除疟原虫肝后期或红前期必须基因，让疟原虫不能进入红内期。与药物减毒疫苗相比，基因减毒疫苗没有引发疟疾传播的风险也不会引发原虫血症，同时作为全虫活疫苗可以激专利技术显的保护效果，是一种优秀的疟疾疫苗策略。但是敲除疟原虫发育必须基因或者毒性基因可能会影响疟原虫生长或者表面抗原的表达。泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasomesystem(UPS))是细胞内非溶酶体途径的蛋白降解通路，其中泛素是一个由76个氨基酸残基组成的在真核细胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白质，其分子量约8.5kDa，可以通过共价键与细胞中的受体蛋白结合。细胞可以通过UPS途径将蛋白降解，对受组成型调节和环境刺激产生的蛋白表达水平进行控制。细胞的多种生理过程，包括细胞凋亡、细胞增生及分化调节内质网蛋白质的质控蛋白转运、炎症反应抗原提呈和DNA修复以及细胞应激反应等等都与UPS有关，另外，UPS可以降解异常蛋白，如未折叠蛋白，受损蛋白，变异及错误转录蛋白，所以UPS对于维持细胞正常功能发挥着重要作用。DDD(DHFRdegradationdomain)调控系统是一种利用泛素蛋白酶系统对目的蛋白进行调控的调控系统，它利用大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(ecDHFR)与目标蛋白融合，通过控制稳定剂添加与否对目的蛋白进行调控。ecDHFR可以被DHFR抑制剂甲氧苄氨嘧啶(TMP)所稳定。当没有添加TMP时，ecDHFR及其融合的蛋白被泛素标记，被蛋白酶体识别并降解。当添加TMP时，TMP与ecDHFR结合并且稳定ecDHFR，使与ecDHFR融合的蛋白保持稳定不被泛素化降解，目的蛋白可以正常表达。TMP与ecDHFR结合从而稳定蛋白不被降解的状态是可逆的，TMP添加可以稳定ecDHFR，TMP撤药会导致ecDHFR及其融合蛋白的降解，另外通过控制TMP的量可以控制目的蛋白的表达水平，所以通过TMP控制目的蛋白是否表达以及控制目的蛋白的表达量非常方便。另外，因为DDD调控系统是通过泛素化降解控制目的蛋白是否表达，所以对分泌表达的蛋白并不能起到调控作用。因此有必要开发一种条件性调控疟原虫必须基因表达的技术，先表达必须基因使疟原虫存活，在获得免疫保护后让疟原虫必须基因不表达，实现减毒。要求调控系统在不添加调控药物时不表达必须基因，添加调控药物后必须基因表达，疟原虫才存活，可以避免存活的疟原虫引起的疟疾传播。专利技术内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EF1g基因用于疟原虫减毒的用途。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种EF1g基因用于疟原虫减毒的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述EF1g基因的名称为elongationfactor1-gamma，基因识别号为PBANKA_1352000，所述EF1g基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；优选地，所述疟原虫为伯氏疟原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫或诺氏疟原虫中的任意一种或至少两种的组合，优选为伯氏疟原虫。3.一种重组载体，其特征在于，所述重组质粒包括EF1g基因；优选地，所述载体为质粒载体、噬菌体载体或病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为质粒载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括调控元件；优选地，所述调控元件置于EF1g基因上游；优选地，所述调控元件为二氢叶酸还原酶调控元件、四环素操纵子调控元件或FKBP12调控元件中的任意一种或至少两种的组合，优选为二氢叶酸还原酶调控元件；优选地，所述二氢叶酸还原酶调控元件的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴祥，苏建华，王美玲，童英，姚永超，秦莉，陈小平，
申请(专利权)人：广州中科蓝华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44