一种筛选抗体的非人模式动物的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基因改造的非人模式动物及其构建方法，以及在筛选抗体方面的应用。所述的非人模式动物基因组中编码抗体重链序列区域敲进可编码跨膜区多肽的序列和连接肽序列。本发明专利技术还公开了筛选抗体的新方法。

Construction and application of a non-human model animal for screening antibodies

The invention discloses a genetically modified non-human model animal and its construction method, as well as its application in screening antibodies. The region encoding the antibody heavy chain sequence in the genome of the non-human model animal knocks in the sequence of the polypeptide encoding the transmembrane region and the sequence of the connecting peptide. The invention also discloses a new method for screening antibodies.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选抗体的非人模式动物的构建方法及其应用
本申请涉及基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
技术介绍
抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。全世界范围内不断有抗体药物进入临床研究并且上市销售，已成为生物技术类药物中最重要的一大类产品。抗体药物也以其独特的优势，逐步超越化学药，成为制药行业中发展最快的领域之一，从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年12月，欧美日等主要市场共上市了超过63个抗体药物，平均每年上市2.6个抗体药物；1999年，全球抗体药物的市场销售额仅有12亿美元，而根据汤森路透数据，2016年全球抗体类药物的市场已超过1000亿美元，预计到2020年，仅Top5销售的抗体药物销售额将达到419亿美元。抗体药物的快速增长促成了一大批生物技术公司和机构参与抗体药物研发，2016年初CFDA的统计数据表明，仅我国就有超过600家企业在抗体药物领域布局。越来越多的公司和研究机构参与了抗体药物研发，研发竞争呈现白热化状态，而由于抗体(生物类似物)本身特殊性，能否快速从众多抗体中的筛选出可以作为新药的抗体是研发的关键(倪健，《中国医药技术经济与管理》，2012年，第(4)卷，第41-45页。在抗体的研发过程中，目前主要的抗体筛选技术分为两类：(1)体外组装抗体库技术：该技术是从B淋巴细胞中扩增全套抗体的轻链和重链基因，利用丝状噬菌体表面展示技术将抗体外扩的基因片段展示于噬菌体表面构成抗体库，通过数个“吸附-洗脱-扩增”循环筛选出抗体基因。除展示在噬菌体表面外，还可以展示在酵母、细菌表面和核糖体上；(2)以杂交瘤技术为基础，通过免疫小鼠产生抗体：一般是使用人抗原免疫小鼠，然后取小鼠的脾脏细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞，利用选择性培养基挑选杂交瘤细胞，然后再次筛选找到分泌抗体的阳性杂交瘤细胞。无论使用哪种技术，上述筛选的最终目的都是得到抗体序列，再进行后续的优化、测试和工业化生产。而这两种筛选方法各有优劣：抗体库技术首先需要建立筛选平台，有一定的技术要求，其次，库容量相对较小，而体外筛选过程没有经过体细胞高突变过程，还需要进行亲和力优化，总体来说筛选效率低。以杂交瘤技术为基础的第二种技术在筛选上具有先天优势(在动物体内完成VDJ重排，并经历体细胞突变过程，筛选的效率和亲和性上都具有优势)，所获得的抗体类型更丰富，但需要的人工操作和重复步骤太多，尤其是阳性杂交瘤的筛选过程通常采用有限稀释法，一般需要重复3-4次才能确定培养板孔中增殖的细胞为单克隆细胞，速度慢、效率低、人工和耗时都较多。综上所述，本领域急需一种更为简便的抗体筛选方法。本专利技术旨在克服现有不足，提供一种快速获得表达抗体细胞的基因工程小鼠，对该小鼠进行抗原免疫后可直接检测、鉴定和分离得到表达抗体的浆细胞，对获得的细胞进行序列分析，可直接获得抗体序列信息，避免上述繁琐的制备抗体库和筛选杂交瘤的过程，进而大大提高抗体研发速度和准确率。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，涉及一种基因改造的非人模式动物的构建方法，所述模式动物基因组中编码抗体重链序列区域敲进可编码跨膜区多肽的序列；使得模式动物接受抗原免疫后，体内产生的具有正常活性的抗体“挂”(保留)在模式动物浆细胞表面。优选的，可编码跨膜区多肽的序列为内源性序列。优选的，所述抗体为IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE；更优选的，所述抗体为IgG抗体；更为优选的，所述抗体为IgG1抗体。优选的，所述编码抗体重链序列区域敲进的序列还包含编码连接肽的序列；进一步优选的，所述编码连接肽的序列选自F2A、P2A或IRES。在本专利技术的一个具体实施例中，所述编码连接肽的序列为F2A。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的基因为Ighg1基因；更优选的，所述模式动物Ighg1基因的第4外显子后3’UTR的终止密码子前敲进可编码跨膜区多肽的序列，其中，所述的可编码跨膜区多肽的序列通过连接肽序列与第4外显子连接。本专利技术所述的构建方法，使用基因编辑技术进行Ighg1基因非人模式动物的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行Ighg1基因非人模式动物的构建。再优选的，所述非人模式动物为非人类哺乳动物；优选的，所述非人类哺乳动物为啮齿类动物；再优选的，所述啮齿类动物为小鼠；最优选的，所述小鼠为C57BL/6或BALB/c。优选的，所述编码跨膜区多肽的DNA序列的全部或部分片段如SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：45中的全部或部分片段所示，所述编码跨膜区多肽的蛋白序列的全部或部分片段如SEQIDNO：4中的全部或部分片段所示。优选的，所述编码连接肽的DNA序列的全部或部分片段如SEQIDNO：1中的全部或部分片段所示，所述编码连接肽的蛋白序列的全部或部分片段如SEQIDNO：2中的全部或部分片段所示。优选的，所述模式动物基因组中包括嵌合Ighg1基因，所述的嵌合Ighg1基因选自下列组中的一种：a)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的序列的部分或全部所示；b)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列与SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的序列同一性程度为至少大约为80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.9％；c)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列与SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的核苷酸序列杂交；d)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列与SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；e)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列具有SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述模式动物基因组中包括嵌合Ighg1基因，所述嵌合Ighg1基因包括编码跨膜区多肽的基因部分和编码连接肽的基因部分，所述嵌合Ighg1基因的嵌合DNA序列如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21的全部或部分所示。进一步优选的，所述模式动物基因组中包括嵌合Ighg1基因，所述嵌合Ighg1基因包括编码跨膜区多肽的基因部分和编码连接肽的基因部分，所述嵌合Ighg1基因编码的蛋白序列选自下列组中的一种：a)所述蛋白序列为SEQIDNO：9或SEQIDNO：22所述氨基酸序列的部分或全部；b)所述蛋白序列与SEQIDNO：9或SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因改造的非人模式动物的构建方法，其特征在于，所述模式动物基因组中编码抗体重链序列区域敲进可编码跨膜区多肽的序列；优选的，可编码跨膜区多肽的序列为内源性序列。

【技术特征摘要】
2017.07.21 CN 20171060285171.一种基因改造的非人模式动物的构建方法，其特征在于，所述模式动物基因组中编码抗体重链序列区域敲进可编码跨膜区多肽的序列；优选的，可编码跨膜区多肽的序列为内源性序列。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述编码抗体重链序列区域敲进的序列还包含编码连接肽的序列；优选的，所述编码连接肽的序列选自F2A、P2A或IRES。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述抗体为IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE；更优选的，所述抗体为IgG抗体；进一步优选的，所述抗体的基因为Ighg1基因；更进一步优选的，所述模式动物Ighg1基因的第4外显子后3’UTR的终止密码子前敲进可编码跨膜区多肽的序列，其中，所述的可编码跨膜区多肽的序列通过连接肽序列与第4外显子连接。4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行Ighg1基因非人模式动物的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人模式动物为非人类哺乳动物；优选的，所述非人类哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠；更进一步优选的，所述小鼠为C57BL/6或BALB/c。6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述模式动物基因组中包括嵌合Ighg1基因，所述的嵌合Ighg1基因选自下列组中的一种：a)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的序列的部分或全部所示；b)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列与SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的序列同一性程度为至少大约为80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.9％；c)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列与SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的核苷酸序列杂交；d)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列与SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；e)表达跨膜区多肽和连接肽序列的DNA序列具有SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：20或SEQIDNO：21所示包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述模式动物基因组中包括嵌合Ighg1基因，所述嵌合Ighg1基因包括编码跨膜区多肽的基因部分和编码连接肽的基因部分，所述嵌合Ighg1基因编码的蛋白序列选自下列组中的一种：a)所述蛋白序列为SEQIDNO：9或SEQIDNO：22所述氨基酸序列的部分或全部；b)所述蛋白序列与SEQIDNO：9或SEQIDNO：22所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.9％；c)所述蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQIDNO：9或SEQIDNO：22所示蛋白的核苷酸序列杂交；d)所述蛋白序列与SEQIDNO：9或SEQIDNO：22所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；e)所述蛋白序列具有SEQIDNO：9或SEQIDNO：22所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，在动物编码抗体重链序列区域敲进可编码跨膜区多肽序列和连接肽序列，其中，使用sgRNA靶位点序列如SEQIDNO：29-37任一项所示；优选的，使用sgRNA靶位点序列为SEQIDNO：32。9.一种权利要求1-8任一所述的构建方法制备的非人模式动物或其后代。10.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂；b)插入的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂。11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Ighg1基因组中编码抗体重链序列区域。12.根据权利要求10或11所述的靶向载体，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭朝设，黄蕤，白阳，张美玲，尚诚彰，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11