一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法。该方法包括，从人肾脏中提取得总RNA，PCR扩增牛β‑casein基因第二外显子上游1062bp片段及其下游1065bp片段分别被插入到骨架载体neo基因的上游和下游作为打把载体的5'同源臂和3'同源臂，将人EPO cDNA插入到5’同源臂下游，构建以neo基因作为正筛选因子的人EPO cDNA基因在牛β‑casein基因座定位整合的打把载体，基于打靶位点序列，设计并构建特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，采用电击转染法将打把载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法。
技术介绍
促红细胞生成素(erythropoietin,简称EPO)是一种造血因子。EPO与红细胞前体细胞表面EPO受体结合，然后促进其血红蛋白的合成，使之增殖分化成红细胞，所以EPO通过控制红细胞前体细胞的增殖、分化和凋亡从而调控红细胞的生成，是一种造血因子。促红细胞生成素除了有造血功能，纠正贫血外，还有很多其他生物学功能。EPO还是细胞保护因子，通过对抗细胞凋亡，抗氧化，抗炎症和促进细胞增殖来保护心脏，脑，肝脏，肾小管等多种器官，通过细胞免疫和体液免疫来调节机体免疫。近年EPO在治疗肾性贫血及肿瘤相关性贫血有一定的疗效，在临床应用中有巨大的潜在价值和应用前景。但是，因为EPO从人或动物体内得率较低，不能满足市场的需求，本专利技术人考虑采用动物乳腺生物反应器来高效制造具有生物活性的糖基化EPO蛋白。动物乳腺生物反应器是乳汁中含有表达产物的转基因哺乳动物的总称；外源基因随机整合到细胞基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法，包括以下步骤：1)从人肾脏中提取总RNA，用RT‑PCR法扩增人EPO cDNA基因；2)人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶载体的构建；3)特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体的构建；4)分离培养牛胎儿的成纤维细胞；5)将步骤2)的打靶载体和步骤3)的CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法，包括以下步骤：1)从人肾脏中提取总RNA，用RT-PCR法扩增人EPOcDNA基因；2)人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶载体的构建；3)特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体的构建；4)分离培养牛胎儿的成纤维细胞；5)将步骤2)的打靶载体和步骤3)的CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。2.如权利要求1所述的方法，所述步骤1)的RT-PCR法扩增，采用的引物为上游引物5'-GCCTCGAGATGGGGGTGCACGAATGTCC-3'，下游引物5'-GCCTCGAGTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3'，并在上下游引物5'端分别引入XhoⅠ酶切位点。3.根据权利要求1所述的方法，步骤2)所构建的基因打靶载体的正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因，即neo基因。4.根据权利要求1所述的方法，步骤2)所构建的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学明，王雅楠，丁海麦，
申请(专利权)人：张学明，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15