本发明专利技术公开了一种CHO细胞基因组内NW_003613638‑1稳定表达蛋白质的应用，所述CHO细胞基因组内用于稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处；所述位点附近范1969591‑1969721围内可被CRISPR/Cas9技术识别的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'为靶序列。本发明专利技术申请在CHO细胞基因组内的固定位置，导入不同蛋白质基因，并进行稳定表达。
Application of a Stable Expression Protein NW_003613638-1 in CHO Cell Genome
The present invention discloses the application of a stable expressed protein NW_003613638 1 in the CHO cell genome. The site used for stable expression of protein in the CHO cell genome is located at the base 196647 of the CHO cell gene NW_003613638.1, and the target sequence is 5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG3'which can be identified by CRISPR/Cas9 technology in the vicinity of the site 1969591 1969721. The invention applies for a fixed position in the genome of CHO cells, introducing different protein genes and stably expressing them.
【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞基因组内NW_003613638-1稳定表达蛋白质的应用
本专利技术涉及基因
，尤其是涉及一种用于稳定表达蛋白质的CHO细胞重组基因。
技术介绍
中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvarycell,CHO)作为生物制药领域的主力细胞系，已经被开发出许多不同种类的CHO细胞系，包括可以用来扩大基因拷贝数的细胞系。然而，转基因拷贝数的增多与目的蛋白质产率提高并不是明确的正相关关系。且即使蛋白质表达增多，多数CHO细胞的表达水平不稳定。当前普遍使用的构建稳定转染细胞的方法耗时耗力，主要是因为需要重复大量的单克隆筛选过程，所以当前在细胞系构建领域普遍期待可以开发出一种能在短时间内，获得高表达及稳定表达的细胞的方法，并且能够确保构建出来的重组细胞系与传统方法相比，有相同的质量水平，以确保监管机构的批准。传统构建外源蛋白质表达细胞系的方法是通过外源基因随机整合到细胞基因组上，再经过系列的高表达单克隆细胞筛选，获得外源蛋白质高表达细胞系。由于位点效应差异的多样性，随机整合产生的重组细胞表达水平各异，因此需要后期花费很长的时间和很多的步骤，用于挑选高表达单克隆细胞。通过随机整合获得的单克隆细胞无法保证多肽/蛋白质在细胞传代中稳定表达，每进行一次重组细胞构建均需要反复进行单克隆筛选，增加了生物制药的研发成本。位点效应妨碍着传统随机整合构建重组细胞系的效率，反复的高表达单克隆筛选费时费力，且成本昂贵。如何克服位点效应，利用定点整合技术，快速高效地获得稳定表达单克隆细胞已经在学术界被讨论了多年，一直未有突破性进展。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种CHO细胞基因组内NW_003613638-1稳定表达蛋白质的应用。本专利技术申请在CHO细胞基因组内的固定位置，导入不同蛋白质基因，并进行稳定表达；此外在实现该定点整合的过程中，无需多次挑选单克隆以获得更高的表达细胞株，节省了大量的时间。本专利技术的技术方案如下：一种CHO细胞基因组内某位点稳定表达蛋白质的应用，所述CHO细胞基因组内用于稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处；所述位点附近1969591-1969721范围内可被CRISPR/Cas9技术识别的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'为靶序列。所述蛋白质为分子量小于160KDa的蛋白质。所述蛋白质为红色荧光蛋白、多肽、功能性蛋白质、抗体、融合蛋白质中的一种。所述靶序列为CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处附近第1969633-1969655碱基处。进一步所述靶序列为5’-CCATGAGGAAAACTTTTTGAGGG-3’。所述靶序列为5’-ATTTATATTCAGTATACATTTGG-3’。所述靶序列为5’-TTTATATTCAGTATACATTTGGG-3’。所述靶序列为5’-GTGTATCTTCGAACCAAAACTGG-3’。所述靶序列为5’-TGTATCTTCGAACCAAAACTGGG-3’。所述靶序列为5’-ACTGGGTCACAAAATGTTTTAGG-3’。所述靶序列为5’-TTTACTCTTTCAACATTCTGAGG-3’。所述靶序列为5’-AACATTCTGAGGACTGCTCAAGG-3’。所述靶序列为5’-AACATTTTGTGACCCAGTTTTGG-3’。一种含有所述用于表达蛋白质的重组供体载体。所述的重组供体载体为CHO细胞表达的载体。所述的重组供体载体的制作方法为：将蛋白基因插入到质粒5’arm和3’arm中间的区域，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，得到重组CHO细胞表达质粒。所述启动子为：CMV(人类巨细胞病毒来源的强哺乳动物表达启动子)、EF-1a(人延长因子1α来源的强哺乳动物表达启动子)、SV40(猿猴空泡病毒40来源的哺乳动物表达启动子)、PGK1(磷酸甘油酸酯激酶基因来源的哺乳动物启动子)、UBC(人类泛素C基因来源的哺乳动物启动子)、humanbetaactin(β-肌动蛋白基因来源的哺乳动物启动子)、CAG(强杂交哺乳动物启动子)中的一种。一种用于稳定表达蛋白质的CHO重组细胞系。一种CHO细胞基因表达蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用所述的重组供体载体转化CHO细胞，得重组CHO细胞；(2)重组CHO细胞在平板上培养，收集上清检测表达水平，以及对贴壁重组CHO细胞进行悬浮驯化；(3)悬浮驯化的重组CHO细胞在小摇瓶内进行培养，并检测蛋白质的表达水平。本专利技术申请还提供一种CHO细胞基因组中稳定表达位点的选择：1)构建带荧光标签的慢病毒，并推算其滴度。将igk-luc基因整合到pLVX-CMV-MCS-T2A-Zsgreen载体的多克隆位点后，再同时利用pSPAX2、pMD2G两个质粒进行三质粒转染至HEK-293T细胞，于48小时及72小时两次取细胞上清液，收集后超速离心上清液获取慢病毒。2)将CHO细胞铺在6孔板上培养过夜，第二天将慢病毒稀释并以较低的MOI(MOI<1)(每个细胞对应病毒颗粒)来感染CHO细胞。感染96小时后，通过流式细胞分选仪分选，将荧光强度最亮的部分细胞直接接种到96孔板内。一周后等细胞长成单克隆集落时，荧光显微镜下观察细胞，选择形态和生长正常，且最亮的集落细胞，转移到24孔板内扩大培养。培养细胞达汇合度近90％时再转移到6孔板内培养，最后再扩大至10cm的培养皿中培养，冻存一部分细胞，剩余细胞继续扩大培养。3)利用染色体步移技术Lenti-XIntegrationSiteAnalysisKit(Clontech:631263)寻找到慢病毒所有的CHO细胞基因整合位点。以荧光强度最亮、细胞形态和生长速度正常的若干个细胞系为材料，采用ADraI,SspI,HpaI三个限制性内切酶对基因组DNA进行过夜酶切。其中基因组DNA有2.5μg，限制性内切酶有80U，配成100μL反应体系。置于37℃下过夜酶切(16-18小时)。利用DNA回收试剂盒将酶切产物纯化回收。将酶切后的基因组DNA4.8μL，加上1.9μL染色体步移接头GenomeWalkerAdaptor(25μM)和0.5μLT4连接酶，配成8μL体系进行连接实验。置于16℃环境下，进行过夜连接。将连接体系70℃下加热5分钟，使连接酶失活。各个体系内加入32μLTEbuffer配置成相应的文库。对文库进行2轮巢式PCR，将LTR区域同临近的基因组区域扩增出来。相关的PCR反应操作步骤可以参照Lenti-XIntegrationSiteAnalysisKit(Clontech:631263)试剂盒说明书进行。最后将PCR产物进行电泳，将主要条带切胶回收后送测序。在获得每个细胞系所有慢病毒整合信息后，选择只有单拷贝慢病毒整合的CHO细胞系的相关信息，并将其序列信息在BLAST上同CHO-K1基因组信息加以比对，找出高表达的整合位点。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术采用定点整合方法，通过把目的基因定点整合到稳定表达区域，能很好的克服随机整合带来的整合位点不确定性的问题，有效的规避了反复多轮的高表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CHO细胞基因组内某位点稳定表达蛋白质的应用，其特征在于，所述CHO细胞基因组内用于稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处；所述位点附近1969591‑1969721范围内可被CRISPR/Cas9技术识别的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'为靶序列。
【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞基因组内某位点稳定表达蛋白质的应用，其特征在于，所述CHO细胞基因组内用于稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处；所述位点附近1969591-1969721范围内可被CRISPR/Cas9技术识别的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'为靶序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为分子量小于160KDa的蛋白质。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为多肽、功能性蛋白质、抗体、融合蛋白质中的一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶序列为CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处附近第1969633-1969655碱基处；所述靶序列为5’-CCATGAGGAAAACTTTTTGAGGG-3’。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶序列为5’-ATTTATATTCAGTATACATTTGG-3’。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶序列为5’-TTTATATTCAGTATACATTTGGG-3’。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李华钟，金坚，周松涛，陈蕴，段作营，龚笑海，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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