黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法。本发明专利技术能在构建黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体时，免除繁琐步骤，简化操作，节省科研成本。本发明专利技术通过简单的方法克隆黔北麻羊TIMP1基因并构建真核表达载体，为黔北麻羊基因检测提供基础方法，便于从基因水平研究其对黔北麻羊繁殖相关性状的影响，为黔北麻羊产羔性状的分子机制提供理论依据。

Construction of eukaryotic expression vector of TIMP1 gene in Qianbei Ma sheep

【技术实现步骤摘要】
黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其是基于黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法。
技术介绍
基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是一种内源性的金属蛋白酶活性抑制剂，最初被认为主要作用于调节基质金属蛋白酶活性和抑制细胞外基质的转化，包括调节细胞增殖、分化、凋亡等，并且在细胞外基质的稳态中发挥关键作用(Lambertetal.，2004)。TIMP1基因是在20世纪70年代初，以胶原酶抑制剂的形式在体外培养的人皮肤成纤维细胞、人血清以及牛软骨和主动脉提取物中发现的。有研究人员发现，TIMP1基因参与调控小鼠的生殖周期，主要作用于子宫和卵巢(Nothnicketal.,2000)。更为重要的是，TIMP1基因也被认为是类固醇生成的调节剂(Boujardetal.，1995)。在绵羊上，发现TIMP1基因在子宫中的表达受激素影响，如雌二醇的调控(Hamptonetal.，1995)。而在山羊上，JiayinPengetal.(2015)研究发现TIMP1基因可以增加山羊输卵管上皮细胞的增殖，表明TIMP1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，包含如下步骤进行：/n1)提取黔北麻羊卵巢组织的RNA，经逆转录获得黔北麻羊卵巢组织的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得TIMP1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与pMD19-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP-N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体；/n2)用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pMD19-T载体连接；连接体系：p...

【技术特征摘要】
1.一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，包含如下步骤进行：
1)提取黔北麻羊卵巢组织的RNA，经逆转录获得黔北麻羊卵巢组织的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得TIMP1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与pMD19-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP-N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体；
2)用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pMD19-T载体连接；连接体系：pMD19-T载体1ul，目的片段5ul，buffer1ul，T4DNA连接酶1ul，ddH2O1ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有AMP抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16hPCR检测菌液阳性克隆，提取重组质粒测序验证；
3)双酶切体系如下：重组质粒、pEGFP-N3(+)空载体各8ul，EcoRⅠ2ul，BamHⅠ2ul，10×QuickCutGreenBuffer2ul，ddH2O补足20ul，37℃恒温水浴锅中酶切3h，用1.5％的琼脂糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥，洪磊，唐文，周志楠，敖叶，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52