基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用技术方案

本发明专利技术提供一种基于CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用，特别是在RNA病毒敲降方面的应用。本发明专利技术利用mCherry荧光报告基因，将PRRSV病毒ORF4和ORF5两个表达阅读框序列分别融合到mCherry基因的碳端构建筛选CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的荧光报告系统，利用CRISPR‑Cas13d高效切割mRNA的特性，进行高效率sgRNAs的快速筛选。然后利用筛选出的高效靶向结合的sgRNAs进行CRISPR‑Cas13d系统高效降解PRRSV‑GFP重组病毒。本发明专利技术提供的RNA病毒敲降方法具有高效率，高精准率及低脱靶率的优势。

Screening method and application of sgRNA efficient target based on crispr-cas13d system

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用
本专利技术涉及基因编辑
，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用。
技术介绍
RNA病毒是一类严重危害人类健康，农业安全生产的病毒。由于其具有高度变异，快速复制，生命活动复杂等特点，RNA病毒的防控及相关疾病的治疗变得尤为艰难。常见RNA病毒及相关疾病的主要防治方法为疫苗、抗体的研发以及RNA干涉技术(RNAi)，但效果都不是很理想，新方法的探索及开发迫在眉睫。近年来，可编程核酸酶介导的基因编辑技术迅猛发展，CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)系统基因编辑技术广泛应用于生物学、基础医学等研究领域中，充分证明了该技术具有巨大的发展潜能。CRISPR系统是细菌和古生物菌免疫防御机制的一部分，在外源的质粒或病毒入侵宿主后，CRISPR通过内部的间隔序列来识别这些外源DNA，并形成记忆。当噬菌体再次入侵时，CRISPR区域内一段序列转录成前体的RNA(pre-crRNA)，pre-crRNAs受到转录活化RNA(tracrRNA)转录活化成为小的成熟的crRNA，结合相关的Cas蛋白形成crRNA-Cas蛋白复合体，再通过碱基互补配对精确的与目标DNA结合，从而指导Cas蛋白对目标DNA进行切割，并由这些核酸内切酶造成靶向的DNA双链断裂(DSBs)。经非同源末端连接(NHEJ)途径修复会出现非特异性的碱基缺失、插入或其他形式突变；DSBs也可利用DNA修复模板，如单链寡聚核苷酸(ssODN)在切割酶切位点经同源重组修复(HDR)纠正突变或是插入新的基因序列[Hsuetal.,2014；KimandKim,2014；Komoretal.,2017]。以Cas9蛋白作用的II型CRISPR系统，由于不需要复杂的蛋白复合体，且系统组成简单而广泛应用于哺乳动物的基因编辑中[BarrangouR&DoudnaJA,2016；Komoretal.,2017]。最新研究表明，Ⅱ类VI型CRISPR效应蛋白Cas13d蛋白可高效切割ssRNA(SilvanaKonermannetal.,2018)。Rfx-Cas13d属于含有2个HEPN核酶基序的2型CRISPR-Cas蛋白家族，长度仅约930aa，是目前最小的2型CRISPR效应物。与其他Cas13酶一样，Cas13d同源物能独立地将CRISPR序列加工成向导RNA。它们依赖crRNA来切割目标，而不依赖HEPN结构域。这些酶对目标的侧翼序列没有要求，因此可以靶向任何RNA序列。CRISPR-Cas13d基因编辑工具的出现将为RNA病毒的敲降提供新的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用。专利技术人基于CRISPR-Cas13d系统介导的ssRNA切割，尤其是Rfx-Cas13d(CasRx)介导的ssRNA切割的高效性，精准性和特异性，提供一种RNA病毒的敲降策略：通过CRISPR-Cas13d系统对mCherry-ORF4/ORF5报告质粒mRNA的切割筛选高效sgRNA，利用筛选出的高效sgRNA进行PRRSV-GFP重组RNA病毒的高效敲降，抑制RNA病毒的复制，从而实现对RNA病毒防治。第一方面，本专利技术提供一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法，包括以下步骤：1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内，得到报告载体；2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA序列，并将这些sgRNA序列分别构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中；3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得重组载体共同导入真核细胞中，得到一系列转化细胞；待转化细胞培养一段时间后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；其中，步骤1)所述目标核酸序列含有或编码5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。所述目标核酸序列包括但不限于mRNA或RNA病毒核酸序列。优选地，RNA病毒为PRRSV(猪蓝耳病病毒)。所述含有报告基团的载体为携带mCherry荧光蛋白的真核表达载体，如pcDNA3.1-mCherry。在本专利技术的一个具体实施方式中，报告载体的构建方法如下：利用载体同源重组的方法将从PRRSV病毒cDNA扩增所得ORF4/ORF5序列连接到常用商业化载体pcDNA3.1-mCherry中mCherry基因的下游，分别构建得到mCherry-ORF4和mCherry-ORF5荧光蛋白报告载体。优选地，所述目标核酸序列位于mCherry荧光蛋白的C端。前述的方法，步骤2)所述基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体为pC0043-PspCas13bcrRNAbackbone哺乳基因编辑质粒(参见SilvanaKonermannetal.TranscriptomeEngineeringwithRNA-TargetingTypeVI-DCRISPREffectors.(2018).Cell)。前述的方法，步骤3)所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES或NLS序列的载体。优选地，所述含有Cas13d蛋白的表达载体的序列如SEQIDNO:3或4所示。更优选地，所述目标核酸序列为PRRSV的ORF4和/或ORF5基因；针对ORF4、ORF5基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核酸序列分别如SEQIDNO:5、6所示。可选地，步骤3)所述真核细胞为HEK293T。第二方面，本专利技术提供根据上述方法获得的高效sgRNA在基于CRISPR-Cas13d系统的(非治疗目的)RNA病毒敲降中的应用。所述应用包括：(1)根据待敲降RNA病毒，选定目标核酸序列，利用上述方法筛选出高效sgRNA；(2)将高效sgRNA序列构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中，所得重组载体与含有Cas13d蛋白的表达载体共同导入到感染了所述待敲降RNA病毒的真核宿主细胞中。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述RNA病毒为PRRSV，所述目标核酸序列为PRRSV的ORF4和/或ORF5基因；针对ORF4、ORF5基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核酸序列分别如SEQIDNO:5、6所示。优选地，所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES序列的载体，其序列如SEQIDNO:3所示。第三方面，本专利技术提供一种用于RNA病毒敲降的试剂盒，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内，得到报告载体；/n2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA序列，并将这些sgRNA序列分别构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中；/n3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得重组载体共同导入真核细胞中，得到一系列转化细胞；待转化细胞培养一段时间后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；/n其中，步骤1)所述目标核酸序列含有或编码5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内，得到报告载体；
2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA序列，并将这些sgRNA序列分别构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中；
3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得重组载体共同导入真核细胞中，得到一系列转化细胞；待转化细胞培养一段时间后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；
其中，步骤1)所述目标核酸序列含有或编码5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标核酸序列为mRNA或RNA病毒核酸序列；
优选地，RNA病毒为PRRSV。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有报告基团的载体为携带mCherry荧光蛋白的真核表达载体；
优选地，所述目标核酸序列位于mCherry荧光蛋白的C端。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体为pC0043-PspCas13bcrRNAbackbone质粒。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES或NLS序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡晓湘，李果，王鑫杰，李宁，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11