【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
1、奶牛乳房炎是指奶牛乳腺实质、间质被致病菌侵入或在外界因素刺激下产生的炎症性疾病，是奶牛养殖业常见三大病之一，可导致牛奶质量、产量下降、受孕率降低、乳房机能丧失。国内外研究表明，奶牛乳房炎病因十分复杂，但主要病因是病原菌感染。b族链球菌(group b streptococcus，gbs)又称无乳链球菌(streptococcus agalactiae)是引起奶牛乳房炎的常见病原菌之一。牛支原体(mycoplasma bovis，mb)是另一种重要病原菌，可引起乳房炎、肺炎、关节炎在内的多种疾病，传染性高，传播能力强。
2、随着人们对食品安全与公共卫生安全的重视度越来越高，使用广谱抗生素治疗乳房炎而造成的药物残留和细菌耐药性问题已无法符合养殖业和奶业健康发展的需求，特别是近日who已正式向全球发出禁止动物使用抗生素的建议。因此，奶牛乳房炎疫苗的研发和使用变得尤为重要。但目前奶牛乳房炎商品化疫苗种类较少，多为针对大肠杆菌或金葡菌的灭活疫苗，且仅能在一定范围内减轻奶牛乳房炎的严重程度，在降低感染率和发病率方面效果不明显，存在免疫谱窄、免疫持效期短、免疫活性低，无法诱导机体产生有效细胞免疫应答等问题。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何制备奶牛乳房炎疫苗。
2、1.本专利技术提供了一种预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗，它的活性称为gbs
3、所述无乳链球菌荚膜多糖提取物按照包括如下步骤的方法制备:用溶菌酶剥离无乳链球菌的荚膜多糖，得到酶解液，对所述酶解液进行离心，收集上清液，所述上清液去除蛋白质后用去离子水透析，得到无乳链球菌荚膜多糖粗提液，将所述无乳链球菌荚膜多糖粗提液通过超滤更换溶剂为ph7.020 mm tri-hcl&0.25m nacl，得到待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液；对所述待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是-ch2-n+-(ch3)3，所采用的洗脱程序为两步洗脱，所述两步，第一步洗脱用ph7.0 20mm tri-hcl&0.25m nacl作为洗脱液，第二步洗脱用ph7.0 20 mm tri-hcl&1m nacl作为洗脱液；将阴离子交换柱层析获得的洗脱峰进行进行凝胶过滤层析，收集含多糖的洗脱峰，得到无乳链球菌荚膜多糖提取物；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括10-600kd；
4、所述ph7.0 20 mm tri-hcl&0.25m nacl由溶剂和溶质组成的ph值为7.0的溶液，溶剂为20mm tri-hcl缓冲液，溶质为nacl且其在溶液中的浓度为0.25m；
5、所ph7.0 20 mm tri-hcl&1m nacl由溶剂和溶质组成的ph值为7.0的溶液，溶剂为20mm tri-hcl缓冲液，溶质为nacl且其在溶液中的浓度为1m；
6、所述蛋白质rp48为如下a1)或a2)的蛋白质：
7、a1)其氨基酸序列如序列表中seq id no.2所示；
8、a2)与a1)具有98％以上同一性且来源于牛支原体的同源蛋白质。
9、所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可为至少98％、99％或100％的同一性。
10、上述疫苗中，所述蛋白质rp48为将核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示的基因导入表达载体后，转入大肠杆菌，大量培养诱导上清表达后分离纯化得到的蛋白质。所述分离纯化使用凝胶层析色谱、离子交换色谱进行。蛋白质rp48的色谱峰型单一且对称，纯度＞95％。
11、上述疫苗中，所述无乳链球菌荚膜多糖具体可来源于ia血清型无乳链球菌。
12、上述疫苗中，所述无乳链球菌荚膜多糖提取物的重均分子量为42.7kda，数均分子量41.4kda，分子量分布系数为1.03；所述无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量为200.1μg/mg；所述无乳链球菌荚膜多糖中的单糖组成为rha:glcn:gal:glc:glcnac的摩尔数比为12.75:2.71:2.59:1:0.57。
13、上述疫苗中，所述偶联中，无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rp48的质量比为1.6-2.2倍的无乳链球菌荚膜多糖提取物：1倍的蛋白质rp48。
14、上述疫苗中，所述偶联为共价键结合，具体可通过碳二亚胺和己二酸二酰肼进行，为所述无乳链球菌荚膜多糖和所述蛋白质rp48通过碳二亚胺(edac)缩合多糖羧基与己二酰二肼(adh)连接。
15、上述疫苗中，所述偶联的无乳链球菌荚膜多糖和蛋白质rp48的制备方法为：
16、s1、将所述无乳链球菌荚膜多糖在0℃预混4-二甲氨基吡啶(dmap)，调节ph值为9.0，加入1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(cdap)活化多糖15min，超滤除杂，得到活化的荚膜多糖；
17、s2、将所述蛋白质rp48在4℃预混碳二亚胺(edac)，调节ph值为5.7，加入己二酸二酰肼(adh)衍生蛋白8h，加入1m甘氨酸猝灭反应，超滤除杂得到衍生的蛋白质rp48；
18、s3、将s1所述活化的荚膜多糖和s2所述衍生的蛋白质rp48在edac存在下偶联8h，超滤除杂，经凝胶层析色谱分离纯化后得偶联的荚膜多糖和蛋白质rp48原液。所述原液中多糖含量6.6～8.6μg/μl，载体蛋白含量3.8～4.4μg/μl，多糖/蛋白偶联率1.6～2.2，游离多糖含量≤20％，游离蛋白含量≤10％。
19、上述疫苗还含有佐剂铝元素、镁元素、il-12、il-15、dda(双十八烷基二甲基溴化铵)，mpl(单磷酰脂质体a)，quil-a(皂素的纯化物)，ribi adjuvant(美国ribi immunochem研究股份有限公司生产)和/或其它佐剂(弗氏佐剂等)。
20、上述疫苗中，活性成分所述偶联的无乳链球菌荚膜多糖和蛋白质rp48与佐剂铝元素，佐剂镁元素的重量份数比可为多糖：蛋白：铝：镁＝20：10：1000：1000；活性成分在生理盐水中的浓度可为2μg/ml(以多糖浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性称为GBS CPS-rP48，所述GBS CPS-rP48是无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质；
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述无乳链球菌荚膜多糖提取物的重均分子量为42.7kDa，数均分子量41.4kDa，分子量分布系数为1.03；所述无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量为200.1μg/mg；所述无乳链球菌荚膜多糖中的单糖组成为Rha:GlcN:Gal:Glc:GlcNAc的摩尔数比为12.75:2.71:2.59:1:0.57。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述偶联，无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48的质量比为1.6-2.2倍的无乳链球菌荚膜多糖提取物：1倍的蛋白质rP48。
4.根据权利要求1-3中任一所述的疫苗，其特征在于：所述偶联通过碳二亚胺和己二酸二酰肼进行。
5.根据权利要求1-4中任一所述的疫苗，其特征在于：所述无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联的方法为：
6.根
7.预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗的制备方法，其特征在于：将权利要求1-6任一中所述无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质作为活性成分，和佐剂混合，得到预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗。
8.根据权利要求1-6中任一所述的疫苗在调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力产品中的应用。
9.权利要求7所述的方法在制备奶牛无乳链球菌荚膜多糖-牛支原体P48蛋白结合疫苗中的应用。
10.权利要求7所述的方法在制备调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性称为gbs cps-rp48，所述gbs cps-rp48是无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rp48偶联得到的物质；
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述无乳链球菌荚膜多糖提取物的重均分子量为42.7kda，数均分子量41.4kda，分子量分布系数为1.03；所述无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量为200.1μg/mg；所述无乳链球菌荚膜多糖中的单糖组成为rha:glcn:gal:glc:glcnac的摩尔数比为12.75:2.71:2.59:1:0.57。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述偶联，无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rp48的质量比为1.6-2.2倍的无乳链球菌荚膜多糖提取物：1倍的蛋白质rp48。
4.根据权利要求1-3中任一所述的疫苗，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴文学，田欣睿，宋佰芬，王朋朋，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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