一种提高基因编辑中同源重组效率的方法技术

一种提高基因编辑中同源重组效率的方法及该方法中用到的质粒，包括以下步骤：首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆；其次，在细胞培养基中加入化合物RS‑1，于37℃下培养24小时，然后采用电穿孔转染法或显微注射技术将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段导入CRISPR‑Cas9基因编辑系统；本发明专利技术的在基因编辑中提高同源重组效率的方法，能够对真核细胞尤其是哺乳动物细胞进行精准基因编辑，适用于任意目的基因，如引入点突变、精准敲除或插入小片段等，相比常规的CRISPR‑Cas9系统可以提升至少50％的同源重组修复效率，针对某些基因位点甚至可以达到2～5倍的提升。

A method to improve the efficiency of homologous recombination in gene editing

【技术实现步骤摘要】
一种提高基因编辑中同源重组效率的方法
本专利技术涉及基因编辑
，具体说是一种在基因编辑中提高同源重组效率的方法。
技术介绍
新一代基因编辑技术CRISPR已经在多个科研领域取得突破性的进展。迄今为止，各种动植物细胞及干细胞的基因都可以被系统编辑，为攻克艾滋病、多种癌症、遗传病及罕见病等顽症提供了可能，具有很好的研究意义。CRISPR系统应用最广泛的为CRISPR-Cas9系统，Cas9为一种核酸内切酶，会在引导RNA(gRNA)的引导下切断与其配对的DNA双链，双链断裂后，细胞会启动DNA修复机制以修复断裂的DNA，由于CRISPR-Cas9系统不参与DNA的修复过程，因此，要进行精准的基因编辑，必须对DNA的修复加以人工干预，使其修复过程向着实验设计的方向进行。在真核细胞中，DNA的修复机制包括两种：非同源重组的末端连接(Non-HomologousEndJoining，NHEJ)和同源重组修复(HomologyDirectedRepair，HDR)，其中NHEJ的修复机制简单，并且始终存在于细胞分裂的中间期，只要DNA发生断裂或损伤，NHEJ就会启动，迅速修复DNA，但是DNA断裂处会引入随机突变；而HDR主要存在于细胞分裂中间期的S期和G2期，由于HDR修复复杂，有多种酶参与，并且需要可以使用的DNA模板。在一般情况下，细胞会利用染色体的另外一个拷贝作为模板修复损伤的DNA。但是，如果在损伤附近有可以利用的其他DNA模板，细胞也会利用这些模板进行DNA修复。DNA发生双链断裂后，由于NHEJ机制贯穿于细胞分裂中间期始终，而且更为简单有效，所以细胞更倾向于利用NHEJ机制修复损伤DNA；这就导致基因编辑中由于NHEJ会引入各种随机突变，从而降低了基因编辑的精准度。为了提高基因编辑的准确性，必须促进HDR修复机制，使细胞更倾向于使用HDR机制修复DNA，因此，加入适当的DNA模板，可以大幅度提高基因编辑的精准度。因此，亟需一种在基因编辑中可以通用的高准确度的同源重组修复的方法，以便对哺乳动物细胞或受精卵的基因进行精准的基因编辑，如引入点突变、敲除或插入小片段等。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种在基因编辑中提高同源重组效率的方法，可以准确的在真核细胞的基因中进行精准的基因编辑，引入点突变，敲除或插入小片段等。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种DNA质粒pU6-CGA-110，包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；DNA质粒pU6-CGA-110的基因序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还包括DNA质粒pU6-CGA-110在提高基因编辑中同源重组效率中的应用。一种DNA质粒pT7-C-111，基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动Cas9基因表达，用于体外合成Cas9mRNA；其基因序列如SEQIDNO：2所示。一种DNA质粒pT7-A-120，基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动AUNIP基因表达，用于体外合成AUNIPmRNA；其基因序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术还包括一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，包括以下步骤：首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆：设计目的基因gRNA序列和单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；设计修复模板的单链DNA；设计PCR引物然后进行分子克隆，将目的基因gRNA序列插入到pU6-CGA-110的特定位点；设计修复模板的单链DNA时，修复模板的单链DNA中引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp，并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键；其次，在细胞培养基中加入化合物RS-1，于37℃下培养24小时，最后将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统。优选的，将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统的方法为电穿孔转染法或显微注射法，具体的：当细胞为非受精卵细胞时，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA，转染完成后持续在含有RS-1的培养基中培养细胞45～48小时；当细胞为受精卵细胞时，利用显微注射的方法合并注射Cas9mRNA，目的基因gRNA、AUNIPmRNA、RS-1化合物和作为修复模板的单链DNA的混合物，注射完成后，在培养基中培养受精卵16～20小时；其中RS-1化合物的注入浓度为8～10μM。进一步优选的，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段和目的基因gRNA片段的方式为转染含有目的基因gRNA序列的DNA质粒pU6-CGA-110。进一步优选的，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段和目的基因gRNA片段的方式为转染Cas9mRNA，目的基因gRNA和AUNIPmRNA。优选的，进行目的基因编辑设计及分子克隆具体包括以下步骤：①设计基因编辑所需的目的基因gRNA序列，并根据序列设计所需的单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；②设计修复模板的单链DNA，引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp；并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键，然后加入目的基因；③设计PCR引物，作为基因编辑后的测序确认；④进行分子克隆，将gRNA的表达序列插入到质粒pU6-CGA-110的特定位点。进一步优选的，进行分子克隆包括以下步骤：首先，用限制性内切酶BsbI将pU6-CGA-110质粒酶切，回收切割后线性化片段；其次，把表达目的基因gRNA的DNA序列在PCR机上退火，设置条件为：37℃30分钟，95℃5分钟，以每秒0.1℃的速率降温至20℃；最后，将退火产物稀释后与切割后线性化的pU6-CGA-110质粒混合，加入T7DNA连接酶进行连接反应，转染质粒至细菌中，接种至培养基，在37℃下培养8～12小时，测序验证序列。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术的DNA质粒pU6-CGA-110，首先，该质粒包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；表达融合蛋白后会在P2A和T2A处切断，独立形成各个蛋白。转染成功后如果有EGFP荧光，可以判定各种蛋白都正常表达；其次，该质粒中还含有gRNA序列，在分子克隆时可以与目的基因的gRNA进行置换，将目的基因的gRNA插入到pU6-CGA-110的特定位点；最后，该质粒还可以体外合成目的基因gRNA；本专利技术的DNA质粒pT7-C-111能够在体外高效合成Cas9mRNA，DNA质粒pT7-A-120在体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA质粒pU6-CGA-110，其特征在于：包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；/nDNA质粒pU6-CGA-110的基因序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA质粒pU6-CGA-110，其特征在于：包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；
DNA质粒pU6-CGA-110的基因序列如SEQIDNO：1所示。


2.权利要求1所述DNA质粒pU6-CGA-110的应用，其特征在于：在提高基因编辑中同源重组效率中的应用。


3.一种DNA质粒pT7-C-111，其特征在于：基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动Cas9基因表达，用于体外合成Cas9mRNA；其基因序列如SEQIDNO：2所示。


4.一种DNA质粒pT7-A-120，其特征在于：基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动AUNIP基因表达，用于体外合成AUNIPmRNA；其基因序列如SEQIDNO：3所示。


5.一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆：设计目的基因gRNA序列和单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；设计修复模板的单链DNA；设计PCR引物然后进行分子克隆，将目的基因gRNA序列插入到pU6-CGA-110的特定位点；
设计修复模板的单链DNA时，修复模板的单链DNA中引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp，并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键；
其次，在细胞培养基中加入化合物RS-1，于37℃下培养24小时，最后将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统。


6.根据权利要求5所述的一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统的方法为电穿孔转染法或显微注射法，具体的：
当细胞为非受精卵细胞时，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链D...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄啸，王玉冰，赵雪，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37