用于治疗糖原贮积病的腺相关病毒载体制造技术

本公开内容描述了用于治疗糖原贮积病，特别是Ia型糖原贮积病的基因疗法应用的改进的腺相关病毒(AAV)载体。描述了重组核酸分子、载体和重组AAV，其包含G6PC启动子/增强子、合成内含子、G6PC编码序列(例如野生型或密码子优化的G6PC编码序列)，以及位于G6PC启动子/增强子和内含子之间以及内含子和G6PC编码序列之间的填充核酸序列。本文公开的重组AAV表现出高效的肝转导并且能够纠正GSD‑Ia的动物模型中的代谢异常。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年11月26日提交的美国临时申请No.61/908,861的优先权，其通过引用的方式全文纳入本文。
本公开内容涉及用于治疗糖原贮积病，特别是Ia型糖原贮积病的基因疗法载体。
技术介绍
Ia型糖原贮积病(GSD-Ia或冯吉尔克病(von Gierke disease)，MIM232200)是由葡萄糖-6-磷酸酶α(G6Pase-α)的缺陷造成的，这是一种主要在肝脏、肾和肠中表达的酶(Chou et al.,Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。由G6PC基因编码的G6Pase-α是通过九个跨膜螺旋锚定在内质网(ER)中的疏水性蛋白质(Chou et al.,Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。这种酶在糖原分解和糖异生的最后步骤中催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)水解成葡萄糖和磷酸。受GSD-Ia影响的患者不能维持葡萄糖稳态，并且具有空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾肥大、高脂血症、高尿酸血症和乳酸血症(lactic academia)(Chou et al.,Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。当前没有GSD-Ia的治愈法。低血糖症可以使用食疗控制(Greene et al.,N Engl J Med 294:423-425,1976；Chen et al.,N Engl J Med 310:171-175,1984)，其能够使患者获得接近正常的生成和青春期发育。但是，较长期的临床并发症及其背后的病理过程依然未被纠正。一种最显著的慢性风险是肝细胞腺癌(HCA)，其在70-80％的超过25岁的GSD-I患者中出现(Chou et al.,Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010；Labrune et al.,J Pediatr Gastroenterol Nutr 24:276-279,1997；Rake et al.,Eur J Pediatr 161(Suppl1):S20-S34,2002)。GSD-Ia患者中的HCA是小的多发性并且无包膜的，并
发症包括局部受压(local compression)和瘤内出血。在10％的GSD-Ia患者中，HCA经历恶性转化成肝细胞癌(HCC)(Chou et al.,Nat Rev Endocrinol6:676-688,2010；Rake et al.,Eur J Pediatr 161(增刊1):S20-S34,2002；Franco et al.,J Inherit Metab Dis 28:153-162,2005)。已经在GSD-Ia的动物模型中进行了使用携带G6Pase-α的重组腺相关病毒(AAV)的基因疗法研究；这些研究已表现出了效力，并且没毒性(Chou and Mansfield,Expert Opin Biol Ther 11:1011-1024,2011中的综述)。之前使用GSD-Ia的小鼠模型的研究已经表明，在G6PC 5'侧翼区的核苷酸-298至+128的CBA启动子/CMV增强子(Ghosh et al.,Gene Ther 13:321-329,2006)、犬G6PC启动子(Koeberl et al.,Gene Ther 13:1281-1289,2006)或人G6PC启动子的指导下表达G6Pase-α的重组AAV将G6Pase-α转基因递送到肝脏并且实现了对这种疾病的长期纠正。但是，尽管这些研究很有希望，但是均没有能够完全纠正肝G6Pase-α缺陷的。
技术实现思路
本文提供了可在用于治疗糖原贮积病，尤其是GSD-Ia的基因疗法应用中使用的重组核酸分子、腺相关病毒(AAV)载体和重组AAV。在一些实施方案中，重组核酸分子包含G6PC启动子/增强子、合成内含子和G6PC编码区，后者任选地被密码子优化用于在人细胞中表达。重组核酸分子还包含位于G6PC启动子/增强子和内含子之间，以及内含子和G6PC编码序列之间的填充核酸序列。在一些特定的非限制性实例中，重组核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸182-4441或SEQ ID NO:3的核苷酸182-4441。在一些实施方案中，重组核酸分子还包含5′和3′反向末端重复(ITR)序列。在一些实例中，重组蚂蚁核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸17-4819或SEQ ID NO:3的核苷酸17-4819。在其他实施方案中，重组核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的完整载体核酸序列。本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体是AAV载体，例如AAV8载体。本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，分离的宿主细胞可以是适合
于AAV增殖的细胞。本文还提供了包含本文公开的重组核酸分子的重组AAV(rAAV)。本公开内容还提供了包含rAAV的组合物。本文还提供了治疗被诊断为患有糖原贮积病的受试者的方法，包括选择患有Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)的受试者并且给予所述受试者治疗有效量的本文公开的rAAV或者包含rAAV的组合物。通过参考附图进行的以下专利技术详述，本专利技术上述的和其他的目的、特征和优点将变得更明显。附图说明图1A-1B是示出了AAV-GPE输注的G6pc-/-小鼠的表型分析结果的图表。(图1A)示出了用1.2×1011vg/小鼠的AAV-GPE输注的雌性G6pc-/-小鼠及其雌性G6pc+/+/G6pc+/-同窝出生仔(littermate)的体重。在图上方示出了输注时的年龄(2天、2周或4周)。(○)，G6pc+/+/G6pc+/-小鼠；(●)，AAV-GPE输注的G6pc-/-小鼠。(图1B)示出了输注AAV-GPE的小鼠的血糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸和乳酸水平。由于每组中各自代谢物的相似性，示出的数据为6-24周龄的合并数据。在2天龄(n＝36)、2周龄(n＝24)或4周龄(n＝9)时向(+/+&+/-)、G6pc+/+/G6pc+/-，(-/-)、G6pc-/-，或(-/-GPE)、G6pc-/-小鼠输注AAV-GPE。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005。图2A-2B是示出了在24小时禁食后野生型和AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中肝G6Pase-α活性和mRNA表达的图表。向7只2周、11只4周、1只15周(*)和1只30周(**)龄的G6pc-/-小鼠输注不同剂量的AAV-GPE；当小鼠为70-90周龄时评估G6Pase-α活性和mRNA表达。(图2A)示出了所指出周龄(W)时的肝G6Pase-α活性。基于与野生型活性相比的小鼠G6Pase-α活性，将小鼠分组为低(AAV-L)、中(AAV-M)和高(AAV-H)。(图2B)AAV-GPE处理的G6pc-/-小鼠中肝G6Pase-αmRNA表达及其与G6Pase-α活性的关系。数据表示为平均值±SEM。在图2B中，*p<0.05，**p<0.005。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸182‑4441或SEQ ID NO:1的核苷酸182‑4441。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.26 US 61/908,8611.一种重组核酸分子，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸182-4441或SEQ ID NO:1的核苷酸182-4441。2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸17-4819或SEQ ID NO:1的核苷酸17-4819。3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组核酸分子，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1的核苷酸序列。4.一种载体，其包含权利要求1至3中任一项所述的重组核酸分子。5.根据权利要求4所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。6.根据权利要求5所述的载体，其中所述AAV载体是AAV血清型8(AAV8)载体。7.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1至3中任一项所述的重组核酸分子，或者所述权利要求4-6中任一项所述的载体。8.一种重组AAV(rAAV)，其包含权利要求1至3中任一项所述的重组核酸分子。9.根据权利要求8所述的rAAV，其中所述rAAV是rAAV8。10...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·J·周，B·J·伯恩，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，佛罗里达大学研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US