一种敲除猪胚胎p66制造技术

本发明专利技术提供一种利用CRISPR‑Cas9基因编辑方法敲除主胚胎中p66shc的方法，具体的操作步骤包括有：（1）设计 Oligo DNA 序列，（2）进行Oligo的连接，（3）构建好的质粒转化与扩增，（4）质粒转染细胞验证敲除效率，（5）p66shc基因的CRISPR‑Cas9系统构建，（6）猪p66shc基因敲除胚胎生产，（7）p66shc基因敲除结果验证；采用本方案有效降低体外胚胎培养过程中的ROS水平，从而通过减少体外培养过程中的损伤等，提高猪胚胎体外生产的效率，最终构建有效的猪胚胎体外生产体系。

【技术实现步骤摘要】
一种敲除猪胚胎p66shc基因的方法
本专利技术主要涉及胚胎工程技术和基因工程领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑方法构建敲除p66shc基因猪胚胎的方法。
技术介绍
早期胚胎的发育与培养环境中的活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)水平有很大的关系。已有研究结果显表明，过氧化氢的存在会诱导小鼠受精卵在体外培养过程中发生周期性停滞、凋亡、坏死等生物学事件[13]。轻微的氧化损伤最初导致线粒体内膜去极化，线粒体基质和细胞内线粒体分布改变；研究发现用H2O2处理48h后，受精卵皱缩，72h后发育停滞，出现DNA碎片，表明在胚胎发育的早期，氧化损伤线粒体致线粒体功能不良，可能导致细胞周期停滞和凋亡的主要原因[13]。有研究表明，胚胎p66shc(66-kilodahonisoformofShcgeneproducts)的表达与ROS水平有着密切的关系，而且研究发现，发现牛早期胚胎发育阻滞中胚胎中的p66shcmRNA水平要显著高于正常的胚胎[10]。大约有14％左右的牛体外生产胚胎阻滞在分裂的2-4细胞阶段，在这些阻滞的胚胎中发现有大量的ROS存本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除猪胚胎p66

【技术特征摘要】
1.一种敲除猪胚胎p66shc基因的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步骤，（1）设计OligoDNA序列在p66shc基因的表达DNA区域中设计一对20bp左右的oligoDNA，可以通过在线工具设计；按照得分优先选择1-3对的Oligo合成；另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp；将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE，准备进行下面的实验；（2）Oligo的连接将合成的2条单链OligoDNA稀释至1μg/μl后，退火形成双链DNA，再与载体连接；pGLKO（Genloci公司购买）是线性载体，无需酶切处理，可直接用于T4DNA连接酶连接反应；（3）构建好的质粒转化与扩增将上述产物按照常规分子克隆技术方法转化到大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增培养后，大量提取质粒，得到构建好的包含敲除p66shc基因的CRISPR-Cas9系统的表达质粒，保存备用；（4）质粒转染细胞验证敲除效率首先解冻培养293T细胞，待生长培养传代2次后，进行转染操作；共转染前提，稀释至质粒浓度为1μg/μl，转染前48小时，接种细胞至备用生产慢病毒的孔板或是培养皿中，转染时，细胞汇合度约为70%-80%为最佳感染状态，活力≥95%以上；以转染时间为起始点，一次收获时间为24h后收获上清，保存于4℃下，如长期保存则在-84℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡军和，晏娇，李甲梅，
申请(专利权)人：湖南人文科技学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43