利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体及突变方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体及突变方法和应用。所述突变方法将cas9mRNA和sgRNA混合后显微注射到家蚕卵中，PCR鉴定基因型，筛选出杂合子，杂合子相互交配获得F1代，F1代中出现纯杂合子，将具有表型的蚕进行基因型检测，将相同基因型的蚕进行交配，筛选出能稳定遗传到下一代的纯合子，继而筛选出家蚕丝素重链基因突变体；sgRNA核心序列针对家蚕丝素重链基因1213～1236、1274～1297或1349～1372位点设计而成。本发明专利技术快速、高效的获得了有经济价值和科研价值的实验材料，为家蚕丝胶茧的规模化生产以及家蚕作为生物反应器表达外源蛋白提供了新材料。

Silk fibroin heavy chain gene mutation and mutation method using CRISPR/Cas technology and Application

The invention discloses a method for obtaining silk fibroin heavy chain gene mutant by using CRISPR/Cas technology, a mutation method and application thereof. The mutation methods cas9mRNA and sgRNA mixed microinjection home eggs, identification of PCR genotypes, screened heterozygote heterozygote mate with each other F1 generation, F1 generation in pure heterozygote, will have the phenotype of the silkworm was genotype detection, the same genotype of silkworm in mating, screening can be inherited to the next generation of homozygous, then screening a silk fibroin heavy chain gene mutant; sgRNA core sequence and the fibroin heavy chain gene 1213 ~ 1236, 1274 ~ 1297 or 1349 ~ 1372 site design. The present invention provides a rapid and efficient experimental material with economic value and scientific research value, and provides a new material for the large-scale production of the silkworm silk cocoon and the expression of the foreign protein as a bioreactor.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家蚕育种和基因工程
，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体及突变方法和应用。
技术介绍
家蚕(Bombyx mori)，鳞翅目蚕蛾科，是由古代野桑蚕驯化而成的绢丝昆虫。以家蚕丝为载体原料的丝绸，是中国古老文化的象征，对促进世界人类文明的发展作出了不可磨灭的贡献。现今，蚕丝业仍是我国特色的经济产业，在世界丝绸业中占有非常重要的地位。蚕丝强韧、柔软、光滑、富有弹性，又具有良好的吸湿性和透气性，因而一直以来绝大部分蚕丝都被用作纺织材料。随着技术的不断革新，现在，蚕丝除作纺织原料外，还可被应用于化妆品、食品、医疗用品、生化用品等领域，用途不断扩大，产品日益增多。蚕丝是由丝素蛋白(Fibroin)和丝胶蛋白(Sericin)两部分组成，丝胶蛋白包在丝素蛋白的外部，约占重量的25％。当熟蚕吐丝时，借丝胶蛋白的胶粘作用使丝素纤维合并合成茧丝，并相互胶着构成紧密不乱的茧层，保持蚕茧的形状。因此丝胶蛋白不仅在茧丝形成过程中起着极为重要的作用，而且在煮茧、缫丝工艺以及丝绸的理化学改性处理等方面具有重要的实用价值。丝胶在茧丝中虽然占有很大的比重，但丝胶在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体的突变方法，其特征在于，将cas9mRNA和sgRNA混合后显微注射到家蚕卵中，PCR扩增后鉴定基因型，筛选出杂合子，将杂合子相互交配获得F1代，F1代中出现纯杂合子，将具有表型的蚕进行基因型检测，将相同基因型的蚕进行交配，筛选出能稳定遗传到下一代的纯合子，继而筛选出家蚕丝素重链基因突变体；所述sgRNA的核心位点序列针对家蚕丝素重链基因+1213～+1236、+1274～+1297或+1349～+1372碱基位点设计而成。

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体的突变方法，其特征在于，将cas9mRNA和sgRNA混合后显微注射到家蚕卵中，PCR扩增后鉴定基因型，筛选出杂合子，将杂合子相互交配获得F1代，F1代中出现纯杂合子，将具有表型的蚕进行基因型检测，将相同基因型的蚕进行交配，筛选出能稳定遗传到下一代的纯合子，继而筛选出家蚕丝素重链基因突变体；所述sgRNA的核心位点序列针对家蚕丝素重链基因+1213～+1236、+1274～+1297或+1349～+1372碱基位点设计而成。2.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体的突变方法，其特征在于，所述sgRNA核心位点序列为CAAGACGTTCGTTATAACCAcgg、CTCATGAAGACACTTTCCGAtgg或GGGCCATACGTATCAAACAGtgg。3.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体的突变方法，其特征在于，所述sgRNA通过以下方法得到：步骤S1，获得家蚕丝素重链基因碱基序列，设计sgRNA核心位点序列；步骤S2，在设计好的sgRNA核心位点序列前部加上T7启动子，在sgRNA核心位点序列后部加上与crRNA/tracrRNA互补的序列，得到完整的sgR...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱亚楠，相辉，王文，陈垒，陈安利，董扬，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53