一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法技术

本发明专利技术属于鱼类分子育种领域，具体涉及一种利用鱼卵保存液提高CRISPR‑Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法。所述方法将鱼卵保存液技术、显微注射技术和CRISPR‑Cas9基因编辑技术三者巧妙的结合起来，大大提高了CRISPR‑Cas9基因编辑技术的打靶效率和基因编辑传代效率，明显地节约了利用基因编辑方法进行鱼类育种的筛选时间，对促进基因编辑鱼类育种的快速发展有着重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类分子育种领域，具体涉及一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法。
技术介绍
基因编辑对研究鱼类基因功能及对其进行鱼类育种与品种改良有着重要的意义。但是，传统的CRISPR-Cas9基因编辑方法打靶效率较低，给基因编辑鱼类的筛选带来繁重的工作，严重阻碍了基因编辑鱼类育种的发展。近年来，许多学者致力于提高基因编辑效率和传代效率方法的研究，有通过在显微注射时共注射可在性腺特异表达的荧光蛋白，实现对生殖细胞进行荧光标记(Dong Z,Dong X,Jia W,et al.,The international journal of biochemistry&cell biology.2014；55:329-34.)。虽然一定程度上由荧光标记提高筛选效率，但是并不能从本质上提高基因编辑效率。另外，根据同源重组效率间接影响基因编辑效率，通过抑制同源重组促进NHEJ修复的方法来提高基因编辑效率(Maruyama T,Dougan SK,Truttmann MC,et al.,Nature biotechnology.2015,33(5):538-42.)。此外，还有通过直接注射Cas9蛋白来提高靶基因的编辑效率(Fujii H,Kotani H,Taimatsu K,et al.,PloS one.2015,10(5):e0128319.)。但是上述现有技术中的方法，都不能很好地提高CRISPR-Cas9基因编辑技术的打靶效率和基因编辑传代效率。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法，包括步骤：(1)收集鱼卵：挑选正常发育成熟的雌鱼，进行人工取卵，收集鱼卵并将其置于鱼卵保存液中保存；(2)显微注射：将步骤(1)中保存在鱼卵保存液中的鱼卵取出，注射Cas9capped RNA和gRNA，将经显微注射后的鱼卵置于鱼卵保存液中保存；(3)人工授精：取出步骤(2)中经显微注射后的鱼卵，加入适量雄鱼精子，进行人工授精，获得受精卵；(4)育种：将步骤(3)中所得受精卵进行培养，获得基因编辑处理的P0代鱼；将所述基因编辑处理的P0代鱼与野生型鱼杂交，获得基因编辑处理的F1代传代鱼。优选地，所述鱼为斑马鱼。优选地，所述鱼卵保存液中含有Leibovitz's L-15和牛血清蛋白。优选地，每1000ml所述鱼卵保存液中，Leibovitz's L-15的体积为800～950ml。更优选为900ml。优选地，每1000ml所述鱼卵保存液中，牛血清蛋白的质量是0.4～0.8g。更优选是0.5g。优选地，步骤(1)中，进行人工取卵时，选择正常性成熟且腹部膨大的雌鱼。优选地，步骤(2)中，保存时，放置于恒温生化培养箱中避光保存。优选地，步骤(3)中，取健康雄鱼解剖获得精巢，加入适量缓冲液进行研磨，取适量精巢研磨液，获得雄鱼精子。优选地，步骤(4)中，所述基因编辑选自：mc4r基因编辑、mrap2b基因编辑、mc3r基因编辑或mpv17基因编辑。本专利技术的第二方面，提供了前述方法在研究鱼类基因功能中的用途。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术将鱼卵保存液技术、显微注射技术和CRISPR-Cas9基因编辑技术三者巧妙的结合起来，大大提高了CRISPR-Cas9基因编辑技术的打靶效率和基因编辑传代效率，明显地节约了利用基因编辑方法进行鱼类育种的筛选时间，对促进基因编辑鱼类育种的快速发展有着重要意义。附图说明图1：鱼卵注射皿示意图。图2：保存在鱼卵保存液中的经显微注射后的卵子。图3：mc4r、mrap2b、mc3r和mpv17基因编辑T7E1检测。图4：注射mcherry mRNA到斑马鱼卵子中，2小时后可见红色荧光蛋白表达(a，白光b，荧光)，证明未受精的卵子具有翻译蛋白的能力。图5：基因编辑效率检测(A)和传代效率检测(B)；nP0和sP0分别表示正常注射和鱼卵保存注射P0代；nf1和sf1分别表示正常注射和鱼卵保存注射F1代。图6：pXT7-Cas9示意图。图7：pUC57-gRNA示意图。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。实施例1一、鱼卵保存液的配制配制鱼卵保存液：取商业化Leibovitz's L-15培养液，加入灭菌去离子水和牛血清蛋白，用10mM NaOH将pH调到9.0，获得鱼卵保存液。所述鱼卵保存液中，Leibovitz's L-15培养液的体积百分比为90％，牛血清蛋白的终浓度为0.5mg/mL。二、人工取卵挑选体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用鱼卵保存液提高CRISPR‑Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法，包括步骤：(1)收集鱼卵：挑选正常发育成熟的雌鱼，进行人工取卵，收集鱼卵并将其置于鱼卵保存液中保存；(2)显微注射：将步骤(1)中保存在鱼卵保存液中的鱼卵取出，注射Cas9 capped RNA和gRNA，将经显微注射后的鱼卵置于鱼卵保存液中保存；(3)人工授精：取出步骤(2)中经显微注射后的鱼卵，加入适量雄鱼精子，进行人工授精，获得受精卵；(4)育种：将步骤(3)中所得受精卵进行培养，获得基因编辑处理的P0代鱼；将所述基因编辑处理的P0代鱼与野生型鱼杂交，获得基因编辑处理的F1代传代鱼。

【技术特征摘要】
1.一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法，包括步骤：(1)收集鱼卵：挑选正常发育成熟的雌鱼，进行人工取卵，收集鱼卵并将其置于鱼卵保存液中保存；(2)显微注射：将步骤(1)中保存在鱼卵保存液中的鱼卵取出，注射Cas9 capped RNA和gRNA，将经显微注射后的鱼卵置于鱼卵保存液中保存；(3)人工授精：取出步骤(2)中经显微注射后的鱼卵，加入适量雄鱼精子，进行人工授精，获得受精卵；(4)育种：将步骤(3)中所得受精卵进行培养，获得基因编辑处理的P0代鱼；将所述基因编辑处理的P0代鱼与野生型鱼杂交，获得基因编辑处理的F1代传代鱼。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鱼为斑马鱼。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鱼卵保存液中含有Leibovitz's L-15和牛血清蛋白。4.根据权利要求3所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴得胜，谢少林，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50