通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法技术

本发明专利技术公开了通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，设计了新的gRNA序列，设计在BMP2a第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG，酶切为HinfI。与传统敲除基因的技术相比，CRISPR/Cas9技术具有毒性小，准确性高，效率高，成功周期短等特点；所以理论上，使得BMP2a基因更快得被敲除。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应CRISPRRNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifyingfactor），能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而RNA可连接到sgRNA的末端，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。相比于传统的Talens等敲基因技术，CRISPR/Cas9具有更高效率，更方便操作，优点如下：1，只需要合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具有特异性。2，编码sgRNA的序列不超过100bp,因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。3，较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。中国专利201510582860.5公开了一种通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法。那么能否利用CRISPR/Cas9技术，设计独特的一段PAM区，使得斑马鱼中的BMP2a基因被完美敲除，又不“误伤”其他基因，形成世界上首例BMP2a敲除的斑马鱼？作为首例BMP2a敲除转基因的模式动物斑马鱼的意义重大，BMP2a是调控铁的主要因素，一旦被敲除，即成功动物模成铁过载的模式动物，可以排除人为因素干预，对于研究铁的表达研究意义重大。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼。为了解决上述的技术问题，本专利技术提供如下技术方案。通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，包括如下步骤：（1）设计了新的gRNA序列，设计在BMP2a第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG，酶切为HinfI；（2）设计并合成gRNA引物，引物见表1：表1——CAS9BMP2a的引物序列为设计的P3:Forwardsequence(5’to3’):CCTCTTCAACCTGACCTCCA；Reversesequence(5’to3’):GTCCGTCTGTGGTCCACTTT；P3：GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGCCCATCACTAGACTCTGTTTTAGAGCTAGAAAT；p4：AAAAGCACCGACTCGGTGCC；gRNA序列GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG；（3）将设计的引物进行PCR，PCR体系如下：gRNA-plasmid10ng；P31ul(10pmol)；P41ul(10pmol)；Buffer10；dNTP8；KOD0.5；ddH2OUpto100ul；PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环（95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环），然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；(4)RNA-Free条件下，将gRNA进行体外转录，体系为：2.5mmol/LNTP4ul；10×ReactionBuffer2ul；TemplateDNA11ug(<6ul)；T7EnzymeMix2ul；DEPCWaterupto20ul；gRNA12.5(ng/ul)；Cas9300(ng/ul)；Tris-Hcl0.2ul；Phenol-red0.2ul；DEPCWaterupto2ul；以上体系37°C，1hour反应完毕，然后进行纯化；(5)将前述纯化的mRNA注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，4天后提取RNA,转录DNA进行测序检测；注射体系如下：gRNA12.5(ng/ul)；Cas9300(ng/ul)；Tris-Hcl0.2ul；Phenol-red0.2ul；DEPCWaterupto2ul；(6)三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎后进行ＲＮＡ提取并转录成ＤＮＡ送测序查看是否有突变，这时候的ＤＮＡ还是双链的；然后将测序后发现突变的斑马鱼的ｃＤＮＡ和１９Ｔ载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过１２－１４小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，得到的是单链的ＤＮＡ，再次送测序，最终得到单链的突变，然后将其培养长大三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到胚胎后查看是否有突变，将突变的斑马鱼挑单克隆测序后养起来；(7)经过三个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，详见步骤（6），得到相同突变（缺失几个碱基）的斑马鱼再次交配，从而得到纯合BMP2a敲除的斑马鱼。作为本专利技术一优选技术方案，步骤（3）和步骤（4）中的纯化方法包括如下步骤：(A)加入体积为1：2-3的水和苯酚/氯仿/异丙醇,混匀后10,000-15,000rpm离心5min.上层移入新的管子，重复该步骤一次；(B)上层移入新的管子，加入150ul氯仿,离心5min；(C)加入1/10体积2.5M醋酸钠以及2.5体积乙醇,-70C冷冻30min；(D)离心10,000-15,000rpm在4C15min；(E)弃掉溶液留沉淀，加入200ul80%乙醇,离心5min，弃掉溶液，干燥后用10-20µlDEPCH2O溶解。与传统敲除基因的技术相比，CRISPR/Cas9技术具有毒性小，准确性高，效率高，成功周期短等特点；所以理论上，使得BMP2a基因更快得被敲除。附图说明图1为本专利技术方法的培育杂交图系。具体实施方式具体实施方式此次实施例中所用的引物均为苏州金唯智公司合成。野生型斑马鱼AB品系，苏州大学生物钟研究中心。具体实验过程：设计gRNA位点-PCR-纯化-体外转录-纯化-显微注射-鉴定活性-饲养至成年-与野生型交配-检测下一代胚胎是否携带突变位点-饲养-成年后剪尾鉴定出杂合突变体-两杂合体交配得到纯合突变体。通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，包括如下步骤：（1）设计了新的gRNA序列，设计在BMP2a第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG，酶切为HinfI；（2）设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，包括如下步骤：（1）设计了新的gRNA序列，设计在BMP2a第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG，酶切为HinfI；（2）设计并合成gRNA引物，引物见表1：表1——CAS9BMP2a的引物序列为设计的P3: Forward sequence (5’to3’):CCTCTTCAACCTGACCTCCA；Reverse sequence (5’to 3’):GTCCGTCTGTGGTCCACTTT；P3：GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGCCCATCACTAGACTCTGTTTTAGAGCTAGAAAT；p4：AAAAGCACCGACTCGGTGCC；gRNA序列GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG；（3）将设计的引物进行PCR，PCR体系如下：gRNA‑ plasmid 10 ng；P3 1 ul(10 pmol)；P4 1 ul(10 pmol)；Buffer 10；dNTP 8；KOD 0.5；ddH2O Up to 100 ul；PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环（95℃‑20s、58℃‑20s、72℃‑20s共30个循环），然后72℃‑10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化； (4) RNA‑Free条件下，将gRNA进行体外转录，体系为：2.5mmol/L NTP 4ul；10× Reaction Buffer 2ul；Template DNA 1 1ug(<6ul)；T7 Enzyme Mix 2ul；DEPC Water up to 20ul ；gRNA 12.5(ng/ul)；Cas9 300(ng/ul)；Tris‑Hcl 0.2ul；Phenol‑red 0.2ul；DEPC Water up to 2ul ；以上体系37°C ，1 hour反应完毕，然后进行纯化；(5) 将前述纯化的mRNA 注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，4天后提取RNA,转录DNA进行测序检测；注射体系如下：gRNA 12.5(ng/ul)；Cas9 300(ng/ul)；Tris‑Hcl 0.2ul；Phenol‑red 0.2ul；DEPC Water up to 2ul；(6)三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎后进行ＲＮＡ提取并转录成ＤＮＡ送测序查看是否有突变，这时候的ＤＮＡ还是双链的；然后将测序后发现突变的斑马鱼的ｃＤＮＡ和１９Ｔ载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过１２－１４小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，得到的是单链的ＤＮＡ，再次送测序，最终得到单链的突变，然后将其培养长大三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到胚胎后查看是否有突变，将突变的斑马鱼挑单克隆测序后养起来；(7) 经过三个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，详见步骤（6），得到相同突变（缺失几个碱基）的斑马鱼再次交配，从而得到纯合BMP2a敲除的斑马鱼。...

【技术特征摘要】
1.通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，包括如下步骤：（1）设计了新的gRNA序列，设计在BMP2a第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG，酶切为HinfI；（2）设计并合成gRNA引物，引物见表1：表1——CAS9BMP2a的引物序列为设计的P3:Forwardsequence(5’to3’):CCTCTTCAACCTGACCTCCA；Reversesequence(5’to3’):GTCCGTCTGTGGTCCACTTT；P3：GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGCCCATCACTAGACTCTGTTTTAGAGCTAGAAAT；p4：AAAAGCACCGACTCGGTGCC；gRNA序列GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG；（3）将设计的引物进行PCR，PCR体系如下：gRNA-plasmid10ng；P31ul(10pmol)；P41ul(10pmol)；Buffer10；dNTP8；KOD0.5；ddH2OUpto100ul；PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环（95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环），然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；(4)RNA-Free条件下，将gRNA进行体外转录，体系为：2.5mmol/LNTP4ul；10×ReactionBuffer2ul；TemplateDNA11ug(<6ul)；T7EnzymeMix2ul；DEPCWaterupto20ul；gRNA12.5(ng/ul)；Cas9300(ng/ul)；Tris-Hcl0.2ul；Phenol-red0.2ul；DEPCWaterupto2ul；以上体系37°C，1h...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宇，朱国兴，仲兆民，杨健，易利华，徐又佳，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32