本发明专利技术提供一种实用的、非侵袭性的、有效的低温保存体外制备的猪胚胎的方法。本发明专利技术方法是在压实之前将在单细胞或分裂期的ＩＶＰ（例如ＩＶＦ－或－ＮＴ－衍生的）胚胎在高同渗质量摩尔浓度的条件下处理，接着进行高速离心。高同渗质量摩尔浓度处理扩大了卵周隙，且离心能够使脂质从细胞质中分离。经过高同渗质量摩尔浓度处理后，脂质分离的胚胎被成功低温保存，后来被恢复和转移以产生活体后代。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种猪胚胎保存的方法，尤其涉及一种新的和改进的体外制备的猪胚胎的保存方法。
技术介绍
早期哺乳动物胚胎的成功低温保存为种质保存以及全国性及国际性遗传学运动提供了机会。令人遗憾的是，猪胚胎比很多哺乳动物胚胎难以低温保存。基于观察到猪胚胎对低温条件非常敏感、去除胞内脂质(去脂)可以减轻这种敏感性，成功低温保存猪胚胎已取得显著的进步。因为考虑与在体外制备胚胎相比更具发展竞争性，大多数研究集中于体内制备胚胎。可选择的机械去脂法包括摇动细胞骨架或改变玻璃化条件。根据早期低温保存在体内制备出的胚胎的研究，猪卵母细胞或者具有完整透明带的胚胎在离心作用之后，极化的脂质微滴往往与卵母细胞的细胞质或者胚的分裂球仍通过桥样结构保持连接。在随后培养或者低温保存过程中，极化脂质微滴能再分配进入卵母细胞或者分裂球。如果卵周隙扩大，在离心作用后桥样结构将破裂，脂质微滴将不再分配进入卵母细胞的细胞质或者胚胎的分裂球，但仍停留在完整的透明带里。因此在体内衍生的胚胎需要在离心作用之后立即低温保存，以防止低温保存之前脂质再分配。之前的研究还发现，猪胚胎初期有丰富的、大的脂质微滴，在胚胎向胚泡期转化并超过时，其尺寸和丰度逐渐下降。有趣的是，早期胚胎里的大脂质微滴比后期胚胎里较小脂质微滴更容易通过离心作用去除。在猪胚胎例如由试管受精(IVF)获得或者通过核转移(NT)衍生的胚胎的体外制备过程中，已经用来建立疾病模型或者作为异体转移的潜在的器官捐献者。结果，对在体外制备的胚胎进行有效的低温保存的需求已经大大增加。然而，与在体内制备的配对物相比， 在体外制备的(IVP)胚胎对低温保存更敏感，因此低温保存更难。迄今，成功实现低温保存IVP胚胎是非常有限的。2006年，专利技术者实验室报告了由低温保存的NT胚胎制备出的两窝转基因小猪气后续，Nagashima等_报告了由低温保存的IVF衍生的胚胎制备成的小猪。然而，这两个成功的报告低温保存IVF或者NT衍生的胚都是通过离心和显微操作使用机械去脂法。因为在显微操作期间能够予以透明带损害，机械去脂大幅增加病原体传播的可能。这也是劳动密集和费时的。其他两组报告尝试使用部分酶消化而随后离心的方法改进猪单性生殖胚和手工克隆胚胎的低温保存的存活率。具体讲，当胰蛋白酶，链霉蛋白酶或者其他酶部分消化透明带后，其尺寸膨胀，这导致卵母细胞质膜和透明带之间的空间的量增加。因此当卵母细胞或者胚胎离心足够时，出现可以使脂质完全分离的空间。然而，当用于脂质分离时，部分酶消化处理存在一些缺点。例如，酶(例如胰蛋白酶或者链霉蛋白酶)能引起单性生殖的卵母细胞激活。另外，酶消化处理可能无法连续工作、并且需要小组紧密地观察和监督，因为酶处理的效果严重依赖于个体批次的酶。而且，两组都没有报告使用酶消化和离心作用方法的联合从低温保存的胚胎制备任何小猪。因此，需要发展一种实用的和非侵袭性的用于脂质分离和低温保存IVP(例如 IVF-衍生的或NT-衍生的)猪胚胎的方法，其适于研究和商业目的。专利技术概述在本专利技术的一个方面，描述一种新的和改进的从体外制备(IVP)(试管受精(IVF) 衍生的或者核转移(NT)制备的)的猪胚胎细胞质中分离或者去除脂质的方法。本专利技术所述的脂质去除方法包括以下步骤(1)在单细胞或者分裂期(在压实之前)制备IVP猪胚胎， (2)凝缩所述胚胎以制备凝缩的胚胎，以及C3)离心凝缩的胚胎以从细胞质中分离脂质，从而制备脂质分离的胚胎。根据本专利技术方法的一个实施例，胚胎的体积可通过高同渗质量摩尔浓度处理进行凝缩。特别是，在处于压实之前单细胞或者分裂期的IVF或者NT衍生的胚胎可暴露于具有预选择的高同渗质量摩尔浓度(比在前的培养基大)的介质中预定的较短时间期间。根据任何标准程序，介质的同渗质量摩尔浓度可以通过向介质中添加下列物质调节盐，例如氯化钠，糖，例如蔗糖，棉白糖，果糖，甘露醇，ortrehalose或者其他有机试剂，例如DMSO或者乙二醇。在本专利技术的另一个方面，描述一种新的和改进的低温保存和后续转移脂质分离的 IVF或者NT衍生的猪胚胎的方法。脂质分离的猪胚胎可在胚胎进一步发育到胚泡期之后被低温保存，并且对其进行玻璃化。玻璃化的胚胎可以加热，它们的透明带去除，并且转移至接受者(例如代孕猪)。附图简述附图说明图1是本专利技术的低温保存和恢复过程的流程图。图2(a)到(f)是在高同渗质量摩尔浓度处理之后试管受精衍生的胚胎的发育过程的照片。图3 (a)到(f)是在高同渗质量摩尔浓度处理之后NT衍生的胚胎的发育过程的照片。图4包括用不同的渗透性(通过氯化钠或者蔗糖调节)处理的胚胎照片(第1排) 和离心处理后它们相应的及时胚胎照片(第2排)。专利技术详述除特殊情况外，本专利技术使用全部技术和科学术语属于本领域普通技术人员所理解通常的范畴。提及的全部出版物，专利申请，专利以及参考文献通过引用并入本文。本专利技术，在前期研究的基础上，教导在早期胚胎发育期脂质去除或者分离，对于低温保存IVP (IVF-或-NT-衍生的)猪胚胎是关键的，并且另外通过部分酶消化来膨胀透明带，可以通过凝缩胚胎的体积以扩大IVP猪胚胎的卵周隙，从而能够使脂质去除/分离更容易。本专利技术还公开了将IVP胚胎暴露于高同渗质量摩尔浓度处理可以凝缩胚胎但仍然使胚胎保有活性。而且，和需要显微操作单个卵母细胞或胚胎的目前去脂方法相比，本专利技术的脂质分离方法可用于一次处理多个胚胎。参照图1，其是通过本专利技术的胚胎凝缩方法来进行本专利技术的低温保存和恢复过程的流程图。图1的步骤1提供预选择的早期发育期、特别是在压实之前单细胞或者分裂期的IVP胚胎。适用任何标准IVP方法，例如IVF或NT。根据本专利技术方法的一个实施例，体外受精过程可开始于从一个或多个猪卵巢的窦状滤泡中抽取卵母细胞。卵母细胞可在成熟培养基中培养至成熟一段时间，然后剥离。示例性成熟培养基可含有 TCM199(Gibco，31100035，Grand Island，纽约)，有 0. 的 PVA， 3. 05mmol/L葡萄糖，0. 91mmol/L丙酮酸钠，0. 57mmol/L半胱氨酸，0. 5 μ g/mL黄体生成素， 0. 5 μ g/mL促滤泡激素，10ng/ml黄体生成素表皮生长因子，75 μ g/mL青霉素和50 μ g/mL链霉素。卵母细胞可在成熟培养基内、在38. 5°C,5% CO2的湿空气中培养约40-44小时。成熟后，卵母细胞可在补充0. 的PVA和0. 的透明质酸酶的TL-HEPES_中由通过旋涡一段时间例如约4分钟清除丘细胞后被剥离。被剥离的卵母细胞在授精之前可以被储存在很多不同的培养基里。良好的培养基可含有TCM 199，有0.6mmol/L碳酸氢钠，2.9mmol/L Hepes,50y g/ml 青霉素，60gy g/ml 链霉素，30mmol/L 氯化钠和;3mg/ml BSA。制备IVP胚胎可遵循任何标准授精方法。根据一个实施例，被剥离的有极体的卵母细胞可首先被转移到合适的IVF介质中与悬浮精子结合。示例性IVF介质可以含有改进 tris-缓冲的培养基，有113. lmmol/L氯化钠，3mmol/L氯化钾，7. 5mmo/L氯化钙，5mmol/L 丙酮酸钠，llmmol/L 葡萄糖，20mmol本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ＩＶＰ猪胚胎的脂质分离的方法，包括：（ａ）在压实之前，在单细胞或分裂期制备ＩＶＰ猪胚胎，（ｂ）使这样的胚胎短时间暴露于具有预选择的同渗质量摩尔浓度的介质以制备凝缩的胚胎，以及（ｃ）在预选择的速度下离心这样的凝缩的胚胎预选择的和时间期间，以制备脂质分离的胚胎。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·S·普莱特尔，
申请(专利权)人：密苏里大学管理者，
类型：发明
国别省市：US
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