【技术实现步骤摘要】
基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法
本专利技术涉及基因体学及基因工程领域，具体地说，涉及一种基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法。
技术介绍
位点特异的转基因整合可以通过同源臂依赖的修复(homology-directedrepair,HDR)途径实现也可以通过介导的末端连接(non-homologyendjoining,NHEJ)的途径实现。通过同源臂依赖的修复途径实现外源基因的精确整合往往是费时费力的，因为对于每一个基因它都需要进行同源臂克隆载体的构建。并且因为只有在细胞的S/G2期时，HDR途径才可以有效的发挥作用，因此在非分裂细胞中，通过HDR介导的外源基因的整合的效率是非常低的。精确的位点特异性外源基因的整合也可以通过一种称为ObLiGaRe(ObligateLigation-GatedRecombination)的方法实现，它是利用zincfingernucleases(ZFNs)或者Talenucleases(TALENs)通过NHEJ途径实现的，但是复杂的设计和高成本限制了它的广泛应用。利用NH...
【技术保护点】
1.基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择合适靶点，设计并合成CrRNA序列：根据CrRNA作用位点的DNA序列5′-TTTV-N
【技术特征摘要】
1.基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择合适靶点，设计并合成CrRNA序列：根据CrRNA作用位点的DNA序列5′-TTTV-N1-N2-……-Nx-5-Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx-3′，其中TTTV为PAM，V表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA序列，并将CrRNA序列构建到含有polII类型启动子、Cas12aDirectrepeat序列以及表达Cas12a的TE4396骨架载体中，得到CrRNA与Cas12a的共表达载体；
2)构建携带CrRNA识别序列和外源基因表达盒的供体载体，其中CrRNA识别序列位于外源基因表达盒的5′端；所述CrRNA识别序列与步骤1)的CrRNA作用位点的DNA中TTTV-N1-N2-……-Nx-5序列相同，但方向相反，所述CrRNA识别序列中远离PAM端的Cas12a识别切割的碱基序列与步骤1)的CrRNA作用位点的DNA中Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx的碱基序列相同，且方向相同；其中，N表示碱基A、T、G或C；
3)将CrRNA、CrRNA与Cas12a的共表达载体和供体载体共同导入真核宿主细胞中，筛选阳性转化子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述Cas12aDirectrepeat序列为5′-aatttctactcttgtagat-3′。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述polII类型启动子为人U6启动子。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，x＝23。
5.基于双Cas12aMITI技术的外源基因定点敲入方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择两个相邻位点作为靶点，分别设计并合成CrRNA1和CrRNA2：根据CrRNA1作用位点的DNA序列5′-TTTV-N1-N2-……-Nx-5-Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx-3′，其中TTTV为PAM1，V表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA1序列；根据CrRNA2作用位点的DNA序列5′-TTTV′-N1′-N2′-……-N′x-5-N′x-4-N′x-3-N′x-2-N′x-1-N′x-3′，其中TTTV′为PAM2，V′表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA2序列，其中P...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴森，杜旭光，李攀，张丽君，李智方，胥春龙，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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