本发明专利技术提供一种基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法。利用Cas12a设计一种依赖微同源臂的外源基因精确定点整合的方法(简称MITI)，该方法通过简单的PCR或T4连接反应即可将识别序列插入到供体载体中，其中Cas12a在供体载体中的识别序列的方向与基因组中的靶点的方向是相反的，但远离PAM端的Cas12a识别切割的5个碱基与基因组靶位点的最后5个碱基是相同的，因此可以利用内外源DNA产生的互补粘性末端实现无缝连接。在将外源基因整合到基因组中的特定位点以及在对内源基因进行标记时，相较已有的Cas9HITI策略，MITI可以产生更高的精准插入效率，其有望成为精准基因插入的新工具。
Site specific typing of foreign genes based on cas12a Technology
【技术实现步骤摘要】
基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法
本专利技术涉及基因体学及基因工程领域，具体地说，涉及一种基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法。
技术介绍
位点特异的转基因整合可以通过同源臂依赖的修复(homology-directedrepair,HDR)途径实现也可以通过介导的末端连接(non-homologyendjoining,NHEJ)的途径实现。通过同源臂依赖的修复途径实现外源基因的精确整合往往是费时费力的，因为对于每一个基因它都需要进行同源臂克隆载体的构建。并且因为只有在细胞的S/G2期时，HDR途径才可以有效的发挥作用，因此在非分裂细胞中，通过HDR介导的外源基因的整合的效率是非常低的。精确的位点特异性外源基因的整合也可以通过一种称为ObLiGaRe(ObligateLigation-GatedRecombination)的方法实现，它是利用zincfingernucleases(ZFNs)或者Talenucleases(TALENs)通过NHEJ途径实现的，但是复杂的设计和高成本限制了它的广泛应用。利用NHEJ途径，CRISPR/Cas9已经在斑马鱼、哺乳动物等细胞中实现了外源基因的方便快捷及高效的定点整合，然而在外源基因和内源靶点的两端的接头处往往会出现各式各样的突变。多项研究致力于优化这个系统，利用通过将FKBP12-L106P降解domain和Cas9相连接，从而控制Cas9蛋白的表达，以及利用相同的gRNA同时切割供体载体和基因靶点的HITI(Homology-independenttargetintegration)策略。利用Cas9可以通过非同源末端连接的途径将外源DNA高效整合到基因组中，然而这些整合通常是不精确的，在外源DNA和内源基因的两端接头处经常会出现突变。Cas12a是Cas12家族最新发现的一个RNA介导的核酸酶，与Cas9相比它拥有多种不同的优势，例如更低的容错率以及更高的特异性，Cas12a可以成熟自己的CRISPRRNAs(CrRNAs)成为成熟的CrRNAs，从而实现多基因的同时打靶。基于这些体外的比较研究，推测Cas12a可用于哺乳动物细胞中基因的精准定点插入。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法。本专利技术构思如下：利用Cas12a切割基因组产生粘性末端(而Cas9产生平末端，Cas9产生的平末端使得它主要利用Gibson组装的方法进行体外分子克隆)，当Cas12a的CrRNA的长度在20nt或者更长的情况下，Cas12a主要切割CrRNA识别序列中PAM序列下游非模板链的第18nt的位置，模板链的第23nt的位置，产生一个5nt的粘性末端；当Cas12a的CrRNA的长度小于20nt的情况下，Cas12a主要切割CrRNA识别序列中PAM序列下游非模板链的第14nt的位置，模板链的第22nt的位置，产生一个8nt的粘性末端。这一特性使得Cas12a能够像限制性内切酶一样实现DNA的体外组装。本专利技术利用Cas12a设计了一种依赖微同源臂的外源基因精确定点整合的方法，该方法通过简单的PCR或者T4连接反应即可将识别序列插入到供体载体中，其中重要的是Cas12a在供体载体中的识别序列的方向与基因组中的靶点的整体方向是相反的，但是远离PAM端的Cas12a识别切割的5个碱基与基因组靶位点的最后5个碱基是相同的，因此可以利用内外源的DNA产生的互补粘性末端实现无缝连接。由于它依赖于5bp的同源序列，故将其命名为MITI(Microhomology-dependentTargetedIntegration)。在将外源基因整合到基因组中的特定位点以及在对内源基因进行标记时，相较已有的Cas9HITI策略，该方法可以产生更高的精准插入效率。此外，利用4个不同的CrRNAs连成的array分别打靶供体载体和基因靶点使之两头产生互补配对的序列，同时结合负向筛选，MITI策略可同时提高两端的插入精确度。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法(单靶点)，包括以下步骤：1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择合适靶点，设计并合成CrRNA序列：根据CrRNA作用位点的DNA序列5′-TTTV-N1-N2-……-Nx-5-Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx-3′，其中TTTV为PAM，V表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数(优选x＝23)，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA序列，并将CrRNA序列构建到含有polII类型启动子、Cas12aDirectrepeat序列以及表达Cas12a的TE4396骨架载体中，得到CrRNA与Cas12a的共表达载体；2)构建携带CrRNA识别序列和外源基因表达盒的供体载体，其中CrRNA识别序列位于外源基因表达盒的5′端；所述CrRNA识别序列与步骤1)的CrRNA作用位点的DNA中TTTV-N1-N2-……-Nx-5序列相同，但方向相反，所述CrRNA识别序列中远离PAM端的Cas12a识别切割的碱基序列与步骤1)的CrRNA作用位点的DNA中Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx的碱基序列相同，且方向相同；其中，N表示碱基A、T、G或C；3)将CrRNA、CrRNA与Cas12a的共表达载体和供体载体共同导入真核宿主细胞中，筛选阳性转化子。本专利技术中，TE4396骨架载体购自Addgene公司，货号74041。本专利技术中，所述polII类型启动子优选人U6启动子。前述的方法，步骤1)中所述Cas12aDirectrepeat(DR)序列为5′-aatttctactcttgtagat-3′(SEQIDNO:1)。第二方面，本专利技术提供基于双Cas12aMITI技术的外源基因定点敲入方法(双靶点)，包括以下步骤：1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择两个相邻位点作为靶点，分别设计并合成CrRNA1和CrRNA2：根据CrRNA1作用位点的DNA序列5′-TTTV-N1-N2-……-Nx-5-Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx-3′，其中TTTV为PAM1，V表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数(优选x＝23)，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA1序列；根据CrRNA2作用位点的DNA序列5′-TTTV′-N1′-N2′-……-N′x-5-N′x-4-N′x-3-N′x-2-N′x-1-N′x-3′，其中TTTV′为PAM2，V′表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数(优选x＝23)，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA2序列，其中PAM1和PAM2相互靠近，呈头对头方式排列；2)构建包含CrRNA1识别序列-外源基因表达盒-CrRNA2识别序列构建体的供体载体；所述CrRNA1识别序列与步骤1)的CrRNA1作用位点的DNA中TTTV-N1-N2-……-Nx-5序列相同，但方向相反，所述CrRNA1识别序列中远离PAM端本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择合适靶点，设计并合成CrRNA序列：根据CrRNA作用位点的DNA序列5′-TTTV-N
【技术特征摘要】
1.基于Cas12a技术的外源基因定点敲入方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择合适靶点，设计并合成CrRNA序列：根据CrRNA作用位点的DNA序列5′-TTTV-N1-N2-……-Nx-5-Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx-3′，其中TTTV为PAM，V表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA序列，并将CrRNA序列构建到含有polII类型启动子、Cas12aDirectrepeat序列以及表达Cas12a的TE4396骨架载体中，得到CrRNA与Cas12a的共表达载体；
2)构建携带CrRNA识别序列和外源基因表达盒的供体载体，其中CrRNA识别序列位于外源基因表达盒的5′端；所述CrRNA识别序列与步骤1)的CrRNA作用位点的DNA中TTTV-N1-N2-……-Nx-5序列相同，但方向相反，所述CrRNA识别序列中远离PAM端的Cas12a识别切割的碱基序列与步骤1)的CrRNA作用位点的DNA中Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx的碱基序列相同，且方向相同；其中，N表示碱基A、T、G或C；
3)将CrRNA、CrRNA与Cas12a的共表达载体和供体载体共同导入真核宿主细胞中，筛选阳性转化子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述Cas12aDirectrepeat序列为5′-aatttctactcttgtagat-3′。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述polII类型启动子为人U6启动子。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，x＝23。
5.基于双Cas12aMITI技术的外源基因定点敲入方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据真核宿主细胞基因组DNA，选择两个相邻位点作为靶点，分别设计并合成CrRNA1和CrRNA2：根据CrRNA1作用位点的DNA序列5′-TTTV-N1-N2-……-Nx-5-Nx-4-Nx-3-Nx-2-Nx-1-Nx-3′，其中TTTV为PAM1，V表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA1序列；根据CrRNA2作用位点的DNA序列5′-TTTV′-N1′-N2′-……-N′x-5-N′x-4-N′x-3-N′x-2-N′x-1-N′x-3′，其中TTTV′为PAM2，V′表示碱基A、C或G，x为20～23之间的整数，设计并合成针对上述作用位点的CrRNA2序列，其中P...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴森，杜旭光，李攀，张丽君，李智方，胥春龙，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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