本发明专利技术公布了一种无抗生素表达外源基因的蓝藻工程菌系统及其制备和应用。所述蓝藻工程菌表达系统包括：聚球藻PCC7002的△psbC突变体和整合载体，整合载体具有核心元件FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB，其中同源片段FlanKA和FlanKB能将P1—MCS—P2—psbC片段整合到聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3的C0006和C0007的基因间区；外源基因插入到多克隆位点MCS中，由启动子P1调控表达；P2—psbC用来回复psbC基因缺失。本发明专利技术让蓝藻不用依赖抗生素培养压力来高效表达外源基因，不仅可大大降低利用蓝藻做生物反应器的成本，更可以减少因抗生素造成的环境污染和不安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蓝藻工程菌系统的制备方法和应用，具体涉及一种无抗生素筛选并持续高效表达外源基因的聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002工程菌系统的制备方法和应用，为蓝藻在发酵工业化中低成本更安全大规模表达外源基因提供了一条途径。
技术介绍
由于蓝藻光合自养、易于基因操作、生长速度快等特点，目前文献上和工业中已有很多利用蓝藻作为生物反应器来表达外源基因的例子，比如：蚊幼毒蛋白基因、脂肪酸不饱和酶基因、羟丁酸聚合酶基因、催化二十碳五烯酸(EPA)合成的脱氢基因、纤维素基因。目前主要通过两种方式将外源基因转入蓝藻：(1)通过穿梭表达载体，定位在染色体基因组外，独立自主进行复制和表达；(2)整合载体，含有蓝藻基因组同源片段，可以选择性地将外源基因嵌合在染色体特定位点上。由于第一种方法穿梭载体的拷贝数低，基因表达量少，所以目前普遍应用的技术是第二种整合载体的方法：在聚球藻PCC7002中，应用pAQ1-Ex整合载体，将外源基因嵌合在聚球藻内源性质粒pAQ1上，并进行表达。但是这些技术都是利用抗生素去筛选阳性菌株，并为了防止今后发酵培养中工程菌丢失外源基因，在培养液中要持续加入抗生素。使用抗生素有许多缺点：(1)而抗生素的培养压力，会导致工程菌的生长速度降低，增加蓝藻的培养时间，增加发酵成本；(2)使用抗生素本身也需要一定的成本；(3)抗生素会造成对环境的污染；(4)抗生素还会影响产品的安全性。所以抗生素的使用，不仅增加了发酵工业的成本，也造成了对环境的污染以及不可靠的产品安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种无抗生素表达外源基因的蓝藻工程菌系统的制备方法和应用，用以解决蓝藻反应器需要依赖抗生素的培养压力来表达外源基因的技术问题。本专利技术利用编码光系统Ⅱ组成蛋白CP43的psbC基因缺失和回复作为选择标记，来筛选阳性克隆，并作为选择压力使得外源基因能在无抗生素的培养条件下持续表达，从而构建了一种无抗生素筛选并持续高效表达外源基因的聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002工程菌系统的制备方法。本专利技术的第一方面，提供了一种蓝藻工程菌表达系统，包括：聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突变体△psbC和用于表达外源基因的整合载体，所述整合载体具有核心元件FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB代表聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3的两段同源片段，交换区域在C0006和C0007基因间区；MCS是用于插入外源基因的多克隆位点；P1代表一种蓝细菌启动子，能够调控插入到MCS中的外源基因的表达；P2代表用于启动psbC基因表达的启动子；psbC代表psbC基因序列。野生型聚球藻PCC7002能够在无甘油的培养基上生长，例如无甘油的普通A+培养基，而聚球藻PCC7002的△psbC突变体必须用含有甘油的培养基培养，例如含甘油的A+培养基。外源基因通过基因工程手段插入到MCS中。将携带了外源基因的整合载体导入聚球藻PCC7002的△psbC突变体中后，同源片段FlanKA和FlanKB能将整合载体上的“P1—MCS—P2—psbC”片段整合到聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3的C0006和C0007的基因间区，其中“P2—psbC”能够回复聚球藻PCC7002的△psbC突变体的psbC基因缺失。上述P1启动子可以是任何一种能够在蓝细菌中调控基因表达的启动子，可以是增强型、组成型或诱导型启动子，例如蓝细菌的强启动子PcpcBA、Cu2+浓度诱导型启动子PpetE。上述P2启动子优选为psbC基因的启动子PpsbDC。在本专利技术的一个实施例中，所构建的整合载体pAQ3-Ex包含核心元件“FlanKA—PcpcBA—MCS—PpsbDC—psbC—FlanKB”，该核心元件的序列如序列表中SEQ ID No：25所示。其中第1～1007位核苷酸序列是FlanKA，第1014～1604位核苷酸序列是PcpcBA，第1611～1808位核苷酸序列是MCS，第1815～2126位核苷酸序列是PpsbDC，第2133～3589位核苷酸序列是psbC，3596～4617位核苷酸序列是FlanKB。本专利技术的第二方面，提供了上述蓝藻工程菌表达系统的构建方法，包括：A.聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突变体△psbC的构建：通过PCR和酶切连接技术获得“psbC基因上游同源臂T1—选择性标记基因—psbC基因下游同源臂T2”的DNA片段，将该DNA片段转入野生型聚球藻PCC7002中，利用同源双交换，使选择性标记基因替换预期灭活的psbC基因，得到聚球藻PCC7002的△psbC突变体；B.整合载体的构建：PCR扩增聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3的两段同源片段FlanKA和FlanKB、蓝细菌启动子P1、多克隆位点MCS、启动子P2、psbC基因，然后用酶切连接的方式构建“FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB”这一排列顺序的DNA片段，将该DNA片段连入一质粒载体中，得到整合载体。在聚球藻PCC7002的△psbC突变体的构建中，所述选择性标记基因常用的是抗生素抗性基因，例如kan抗性基因。在整合载体的构建中，所述“FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB”DNA片段连入的质粒载体可以是各种系列的原核表达载体，例如质粒pGEM-7zf。本专利技术的第三方面，提供了一种利用上述蓝藻工程菌表达系统表达外源基因的方法，包括以下步骤：1)将外源基因插入整合载体的多克隆位点区，得到表达载体；2)用表达载体转化聚球藻PCC7002的△psbC突变体，在无甘油培养基上筛选出阳性菌株，然后利用无甘油培养基培养阳性菌株并检测外源基因的表达，实现无抗生素培养来表达外源基因的目的。上述步骤2)所述无甘油培养基通常是无甘油的普通A+培养基，培养条件一般是在25℃、1％CO2空气、50μE/m2.s的光强下。在本专利技术的实施例中，将这种方法应用在表达GFP蛋白上，发现利用这种方法得到的工程菌能在无抗生素的培养条件下高效持续表达GFP蛋白并且其生长速度与野生型菌株相近。这些结果证明了本专利技术具有实际可行性。本专利技术可以让蓝藻不用依赖抗生素培养压力来高效表达外源基因，这不仅可以缩短培养时间并大大降低利用蓝藻做生物反应器的成本，更可以减少因抗生素造成的环境污染和不安全性。附图说明图1.聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的psbC基因缺失突变体△psbC构建的原理图(A)及Southern鉴定结果(B)。图2.外源基因表达整合载体pAQ3-Ex和试验表达载体pAQ3-egfp的构建示意图，其中：A为聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3示意图：FlanKA和FlanKB指两个同源片段，交换区域在C0006和C0007基因间区；B为整合载体pAQ3-Ex的构建示意图，其中所示的酶切位点均为单一酶切位点；C为外源试验基因egfp插入整合载体后得到表达载体pAQ3-egfp示意图；D为试验表达载体pAQ3-egfp与聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3发生双交换同源重组示意图。图3.pAQ3-EGFP阳性菌株的纯合验证本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蓝藻工程菌表达系统，包括：聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突变体△psbC和用于表达外源基因的整合载体，所述整合载体具有核心元件FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB代表聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3的两段同源片段，交换区域在C0006和C0007基因间区；MCS是用于插入外源基因的多克隆位点；P1代表一种蓝细菌启动子，能够调控插入到MCS中的外源基因的表达；P2代表用于启动psbC基因表达的启动子；psbC代表psbC基因序列。
【技术特征摘要】
1.一种蓝藻工程菌表达系统，包括：聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突变体△psbC和用于表达外源基因的整合载体，所述整合载体具有核心元件FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB代表聚球藻PCC7002内源质粒pAQ3的两段同源片段，交换区域在C0006和C0007基因间区；MCS是用于插入外源基因的多克隆位点；P1代表一种蓝细菌启动子，能够调控插入到MCS中的外源基因的表达；P2代表用于启动psbC基因表达的启动子；psbC代表psbC基因序列。2.如权利要求1所述的蓝藻工程菌表达系统，其特征在于，所述P1是蓝细菌的强启动子PcpcBA或者Cu2+浓度诱导型启动子PpetE。3.如权利要求1所述的蓝藻工程菌表达系统，其特征在于，所述P2是psbC基因的启动子PpsbDC。4.如权利要求1所述的蓝藻工程菌表达系统，其特征在于，所述整合载体的核心元件FlanKA—P1—MCS—P2—psbC—FlanKB的序列如序列表中SEQ ID No：25所示。5.权利要求1～4任意一项所述的蓝藻工程菌表达系统的构建方法，包括：A.聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突变体△psbC的构建：通过PCR和酶切连接技术获得“psbC基因上游同源臂T1—选择性标记基因—psbC基因下游同源臂T2”的DNA片段，将该DNA片段转入野生型聚球藻PCC7002中，利用同源双交换，使选择...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑正高，董春霞，赵进东，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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