多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用，其方法为：制备膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；将TAT‑NLS多肽水溶液与核酸水溶液混匀；得混合液；将基因载体(I)配成悬浮液；(4)悬浮液和混合液混匀，静置，得到多重靶向修饰的载基因复合物；本发明专利技术的多重靶向修饰的载基因复合物。通过膜靶向肽中的REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体特异性识别，提高细胞对其摄取。进入细胞后的复合物位于溶酶体/内涵体结构中，通过聚乙烯亚胺与TAT共同作用，提高该复合物的内涵体逃逸能力，促进目的基因进入细胞质中。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进目的基因的核内在化。目的基因在内皮细胞中的转染效率强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用，属于具有生物靶向识别功能的基因载体

技术介绍
目前，心血管疾病日益盛行。由于临床治疗效果不佳以及巨额的治疗费用，心血管疾病是全球造成死亡的主要原因之一。基因疗法是很有前景的治疗先天和后天性心血管疾病的方法。随着心力衰竭及相关心血管疾病的病理生理学分子途径的识别，基因治疗的预临床试验在小型和大型动物模型上纷纷展开，并逐步走向临床，然而，最初的临床效果并没有达到预期的目标。病毒载体因其固有的致命性免疫原性，虽然转染效果较好，但仍备受争议。非病毒基因载体很好地避免了病毒载体的这一问题，但是转染效率差、基因表达水平低以及无法在目标组织或细胞累积是其面临的主要问题。为了促进载基因复合物在内皮细胞的传递，增强目的基因的表达，本课题组采用内皮细胞靶向性肽REDV(Arg-Glu-Asp-Val)修饰的方法，特异性增强载基因复合物与内皮细胞的相互作用，进而促进细胞摄取实现高转染。然而，载基因复合物实现基因的表达需要经历复杂的细胞内运输途径，其中最关键的两步就是内涵体/溶酶体逃逸和核内在化。载基因复合物通过内吞途径进入细胞后形成小泡进而发育成内涵体、溶酶体。溶酶体内pH值急剧下降，富含的各种酸性水解酶达到最佳活性，降解质粒DNA而使载基因复合物丧失转染能力，因此实现载基因复合物的内涵体逃逸很重要。穿膜肽是一类具有特定功能的、可以与细胞的膜结构作用并促进穿透的短链分子。因此，穿膜肽可用于载基因复合物的细胞摄取及内涵体逃逸。TAT是最常用的细胞穿膜肽，其内部富含带正电荷的精氨酸片段。正是由于TAT聚阳离子的特点，可通过共价键将TAT多肽与寡核苷酸连接，也可以通过正负电荷的相互作用形成TAT/DNA复合物而用于基因转染。但是，TAT在不同细胞和组织的细胞摄取不具有特异性，且单独TAT/DNA复合物的转染效率很低，因此，能否通过TAT与靶向纳米粒协同作用，进一步赋予靶向载基因复合物穿膜性能来促进核酸在内皮细胞中的特异性转染。另外，基因的表达是在细胞核内经转录形成mRNA来实现。研究表明，当在细胞质中注射基因时，其表达只有不到10％。而直接向细胞核内注射可实现高达50％的基因表达。因此核内在化是增强基因表达，提高治疗效果的又一关键。细胞核表面的核膜只允许小颗粒自由穿行，而对于粒径大于10nm的颗粒(如蛋白和DNA)需要经核膜上的核定位信号(NLS)来传送，因此可利用NLS来提高核酸向核内运送的能力。目前对于这种多重靶向修饰的载基因复合物在促进内皮细胞转染方面的研究还较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种生物靶向识别性能好，转染效率高，生物毒性低的多重靶向修饰的载基因复合物。本专利技术的第二个目的是提供一种多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供一种多重靶向修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞药物的应用。本专利技术的技术方案概述如下：多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法，包括如下步骤：(1)在氮气保护下，将重均分子量为26000-30000的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、重均分子量为2000-7500的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，在混合溶剂中溶解，在室温、避光条件下反应2-4h，加入膜靶向肽，反应4-8h，产物在蒸馏水中透析48-72h，冷冻干燥，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亚胺的重均分子量相同，且为10000。所述混合溶剂由体积比为1：(2-4)的pH为8.0-9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、所述的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比为1：(1-20)：(0.5-20)；所述膜靶向肽为Cys-X-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，所述X为0-5个Gly、或0-5个Ala、或0-5个Gly和Ala的任意组合；(2)室温下，按简写为TAT-NLS多肽与核酸的质量比为(0.5-1.2)：1的比例，将TAT-NLS多肽水溶液与核酸水溶液混合均匀，静置20-40分钟；得到混合液；(3)将所述基因载体(I)配成浓度为0.1-0.8mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液；(4)将所述基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置20-40分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为10-30：1。上述方法制备的多重靶向修饰的载基因复合物。上述的多重靶向修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞基因药物的应用。本专利技术的多重靶向修饰的载基因复合物集多重靶向识别与基因于一身。通过膜靶向肽中的REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体特异性识别，提高细胞对多重靶向修饰的载基因复合物的摄取。进入细胞后的多重靶向修饰的载基因复合物位于溶酶体/内涵体结构中，通过聚乙烯亚胺与细胞穿膜肽TAT的共同作用，提高多重靶向修饰的载基因复合物的内涵体逃逸能力，促进目的基因进入细胞质中。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进目的基因的核内在化。目的基因在内皮细胞中的转染效率也就随之增强。附图说明图1为膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体荧光图：图中1为0.45mg/mL的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物的荧光发射光谱图；2为0.65mg/mL膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)的荧光发射光谱图；3为0.10mg/mL的CREDVW多肽的发射光谱图。图2为多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(B)和对照(pGFP/REDV-NP)(A)，在不同氮磷摩尔比(N/P)结合时的流体力学直径分布图。图3为多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(B)和对照(pGFP/REDV-NP)(A)，在不同氮磷摩尔比(N/P)结合时的Zeta电位分布图。图4为多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(B)和对照(pGFP/REDV-NP)(A)在不同N/P比时的琼脂糖凝胶电泳成像图。图5为膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(REDV-NP纳米粒)(A)、pGFP/REDV-NP(B)、多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(C)和pGFP/PEI10000(D)复合物(N/P＝20)对人脐静脉内皮细胞的细胞毒性考察效果图。(PEI10000指代重均分子量为10000的支化聚乙烯亚胺)。图6为人脐静脉内皮细胞被不同的载基因复合物转染24h后的荧光图(A、B、C、D)及其对应的明场图(A’、B’、C’、D’)：A和A’为单独pGFP在脐静脉内皮细胞的转染结果(空白对照)；B和B’为pGFP/REDV-NP在脐静脉内皮细胞的转染结果(阴性对照)；C和C’为TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在本文档来自技高网...

【技术保护点】
多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)在氮气保护下，将重均分子量为26000‑30000的聚乙烯亚胺‑聚(乙交酯‑co‑己内酯)‑聚乙烯亚胺共聚物、重均分子量为2000‑7500的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，在混合溶剂中溶解，在室温、避光条件下反应2‑4h，加入膜靶向肽，反应4‑8h，产物在蒸馏水中透析48‑72h，冷冻干燥，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；所述聚乙烯亚胺‑聚(乙交酯‑co‑己内酯)‑聚乙烯亚胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亚胺的重均分子量相同，且为10000。所述混合溶剂由体积比为1：(2‑4)的pH为8.0‑9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；所述聚乙烯亚胺‑聚(乙交酯‑co‑己内酯)‑聚乙烯亚胺共聚物、所述的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比为1：(1‑20)：(0.5‑20)；所述膜靶向肽为Cys‑X‑Arg‑Glu‑Asp‑Val‑Trp，所述X为0‑5个Gly、或0‑5个Ala、或0‑5个Gly和Ala的任意组合；(2)室温下，按简写为TAT‑NLS多肽与核酸的质量比为(0.5‑1.2)：1的比例，将TAT‑NLS多肽水溶液与核酸水溶液混合均匀，静置20‑40分钟；得到混合液；(3)将所述基因载体(I)配成浓度为0.1‑0.8mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液；(4)将所述基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置20‑40分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺‑聚(乙交酯‑co‑己内酯)‑聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为10‑30：1。...

【技术特征摘要】
1.多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)在氮气保护下，将重均分子量为26000-30000的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、重均分子量为2000-7500的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，在混合溶剂中溶解，在室温、避光条件下反应2-4h，加入膜靶向肽，反应4-8h，产物在蒸馏水中透析48-72h，冷冻干燥，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亚胺的重均分子量相同，且为10000。所述混合溶剂由体积比为1：(2-4)的pH为8.0-9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、所述的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比为1：(1-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯亚凯，杨静，李茜，郭锦棠，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12