靶向人IRAK1基因的小干扰RNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体是一种治疗龋病的靶向人IRAK1基因的小干扰RNA序列及其应用，所述的小干扰RNA包括正义链和反义链，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的反义链的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。本发明专利技术获得的小干扰RNA序列未见于以往公开的报道，能在IRAK1基因的转录后进行干扰，从而特异性降低IRAK1的蛋白表达，可降低炎症牙髓干细胞中NF‑κB的表达，降低牙髓干细胞炎性因子‑肿瘤坏死因子的生成，抑制炎症的发展，促进牙髓干细胞的成牙本质分化，为龋病提供新的治疗方案。

Small interfering RNA targeting human IRAK1 gene and application thereof

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular small interfering RNA sequence for treating dental caries targeting human IRAK1 gene and its application, small interference RNA which includes the sense and antisense chain, the nucleotide sequence of the sense strand is shown in SEQ ID NO:2; antisense nucleotide sequence the as shown in SEQID NO:3. The invention has small interference RNA sequences not found in previous public reports, can interfere in the transcription of the IRAK1 gene, and the specific expression of IRAK1 protein decreased, can reduce the expression of NF kappa B inflammation of the dental pulp stem cells, reduce the generation of inflammatory factors of dental pulp stem tumor necrosis factor, development inhibition of inflammation, promote the differentiation of dental pulp stem cells into dentin, provide new treatment for dental caries.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说，是靶向人IRAK1基因的小干扰RNA序列及其应用。
技术介绍
龋病(dental caries)是由口腔中多种因素复合作用所导致的牙体硬组织发生的慢性、进行性病损，其发病率高、人群分布广，是口腔的常见病和多发病之一。传统机械去龋法是目前临床上牙体治疗的主要方法，主要应用金刚砂钻头的切割作用去除龋坏组织，但应用中容易损伤健康牙体组织，并且钻头切割产生的热量和液体降温时对冷刺激容易激惹牙髓组织，造成不良预后。因此，寻找新的替代疗法，对于龋病的治疗具有重要的意义。IRAK1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1)是IRAK家族成员，通过其激酶活性和接头分子的作用，介导包括Toll样受体(Toll like receptor，TLR)信号通路在内的一系列信号转导，最终导致前炎症细胞因子等基因的表达，参与细胞内的信号网络调控和炎症反应。G-菌的LPS等组分通过激活TLR-MyD88-IRAK1活化NF-κB介导下游炎症因子释放，其下游分泌的TNF-α及RANKL为破骨因子，刺激破骨细胞分化、活化，导致骨诱裂的形成，与牙髓炎、牙周炎、龋齿等病理进程密切相关。RNA干扰(RNA interference，RANi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象，能特异干扰靶基因的表达。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-25nt及3’端突出的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而抑制相应基因表达。目前已成为一门独立的技术，作用靶点特异性高、对细胞毒性小、相对安全，引起生物医学界所有研究领域的广泛兴趣。
技术实现思路
本专利技术的目的在于以最新的IRAK1基因序列为靶点，提供一种治疗龋病的新的特异性抑制人IRAK1基因表达的小干扰RNA序列及其应用。本专利技术的第一方面，提供一种靶向人IRAK1基因的小干扰RNA的靶标基因，所述的靶标基因的核苷酸序列为5’-CCGAAGAAAGTGATGAATT-3’，如SEQ ID NO:1所示。本专利技术的第二方面，提供一种靶向人IRAK1基因的小干扰RNA，由下述正义链和反义链组成：正义链：5’-GCCCGAAGAAAGUGAUGAAUU-3’(SEQ ID NO:2)；反义链：5’-AAUUCAUCACUUUCUUCGGGC-3’(SEQ ID NO:3)。本专利技术的第三方面，提供上述靶向人IRAK1基因的小干扰RNA的靶标基因在制备治疗龋病药物中的应用。本专利技术的第四方面，提供上述靶向人IRAK1基因的小干扰RNA在制备治疗龋病药物中的应用。所述的靶向人IRAK1基因的小干扰RNA特异性降低IRAK1的蛋白表达，抑制炎症的发展，促进牙髓干细胞的成牙本质分化。本专利技术的第五方面，提供一种治疗龋病的药物组合物，所述的药物组合物包括上述靶向人IRAK1基因的小干扰RNA和药学上可接受的载体。所述的药学上可接受的载体为药学上可接受的赋形剂，悬浮剂，填充剂和/或稀释剂。本专利技术优点在于：本专利技术获得的小干扰RNA序列未见于以往公开的报道，能在IRAK1基因的转录后进行干扰，从而特异性降低IRAK1的蛋白表达，可降低炎症牙髓干细胞中NF-κB的表达，降低牙髓干细胞炎性因子-肿瘤坏死因子(TNF-α)的生成，抑制炎症的发展，促进牙髓干细胞的成牙本质分化，可为治疗龋病提供新的方案。附图说明图1是siRNA对牙髓干细胞IRAK1蛋白的下调作用。(图示为Western blot检测IRAK1蛋白表达量，依次为空白组，对照组和siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4组；GD为内参。提示仅siRNA1能显著降低IRAK1蛋白的表达，因此下文中的siRNA若无特殊说明皆指siRNA1)。图2是western blot检测siRNA对牙髓干细胞在重度炎症下成牙本质分化的影响。A为牙髓干细胞在50ng/mL TNF-α刺激下成牙本质分化培养14天后成牙本质标记物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dental matrix protein-1,DMP1)的表达。B为统计学结果。结果表明：siRNA能明显提高牙髓干细胞的成牙本质分化能力，特别是在50ng/mL TNF-α刺激下，牙髓干细胞的成牙本质能力明显提高，成牙本质标记物DSPP、DMP1的表达明显增高。提示该siRNA具有促成牙本质分化能力。图3是ALP染色检测siRNA对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响。A为牙髓干细胞在50ng/mL TNF-α刺激下成牙本质分化培养14天后ALP染色。B为统计学结果，与对照组相比，siRNA在高度炎症下能明显促进牙髓干细胞的成牙本质分化能力。图4是茜素红染色检测siRNA对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响。A为牙髓干细胞在50ng/mL TNF-α刺激下成牙本质分化培养14天后茜素红染色。B为统计学结果，与对照组相比，siRNA在高度炎症下能明显促进牙髓干细胞的成牙本质分化能力。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。本专利技术所有方法中未注明具体条件的实验方法，所用试剂如无特殊说明均购自Invitrogen，干扰序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。实施例中的实验方法通常按照常规条件，参考分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例1：靶向人IRAK1基因特异性干扰序列的获得根据NCBI公开的人IRAK1基因序列(Genbank:NM_001025243)设计siRNA序列，具体设计参考美国Invitrogen公司网站(其网站http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/sort.do)提供的RNAi在线设计软件，经过比对筛选获得含19个碱基的靶基因序列：5’-CCGAAGAAAGTGATGAATT-3’(SEQ ID NO:1)，对应的siRNA干扰序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，具体如下：正义链：5’-GCCCGAAGAAAGUGAUGAAUU-3’(SEQ ID NO:2)反义链：5’-AAUUCAUCACUUUCUUCGGGC-3’(SEQ ID NO:3)实施例2：牙髓干细胞培养及Western blot检测siRNA对IRAK1蛋白表达的效果1)实验过程中的牙髓细胞来源于临床上正常以及龋病的第三磨牙和因正畸需要拔除的第二前磨牙，患者年龄15-25岁，患者全身情况良好。取得入组人员知情同意，并经南通大学附属医院医学伦理委员会批准。将拔除的牙齿立即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向人IRAK1基因的小干扰RNA的靶标基因，其特征在于，所述的靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向人IRAK1基因的小干扰RNA的靶标基因，其特征在于，所述的靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种靶向人IRAK1基因的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA包括正义链和反义链，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求1所述的靶向人IRAK1基因的小干扰RNA的靶标基因在制备治疗龋病药物中的应用。4.根据权利要求2所述的靶向人IRAK1基因的小干扰RNA在制备治疗龋病药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬梅，刘晓娟，宋亦华，张烨，冯兴梅，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32