一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用，属于基因工程应用领域。所述的sgRNA导向序列的核苷酸序列为GCTGCAAGGAAAGATCCAAG。本发明专利技术根据sgRNA导向序列设计合成两条单链oligo序列，退火形成双链，然后与Cas9载体连接，利用Cas9载体将sgRNA以及CRISPR系统引入目标细胞中，Cas9蛋白会在sgRNA的引导下找到与其匹配的DNA序列，进行剪切，实现ABCG2基因的敲除。本发明专利技术提供的sgRNA导向序列，可通过CRISPR‑Cas9系统敲除或编辑ABCG2基因，进而抑制或消除ABCG2的表达能够有效的解决在肿瘤治疗中出现的多药耐药问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程应用领域，尤其涉及一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用。
技术介绍
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在进化过程中演变出来的一种用于抵御外来侵害的免疫入侵系统，包括抵御入侵的病毒以及外源DNA。在现代基因工程应用领域与TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及ZFN(zinc-finger nuclease)技术并列成为三大基因组编辑工具。相比较于TALEN及ZFN技术，CRISPR-Cas9技术具有特异性DNA识别能力，在第二类CRISPR系统中，Cas9核酸内切酶在sgRNA引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。其sgRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN识别模块的构建过程，且毒性远远低于ZFN技术。但是CRISPR-Cas9技术也有上下文依赖性的缺点，目前只能应用于上游有PAM序列的靶位点。多药耐药性(MDR)是指对一种药物具有耐药性的同时，对其他结构不同，作用靶点不同的抗肿瘤药物也具有耐药性。多药耐药性是导致癌症药物治疗和肿瘤化疗失败的重要原因之一。而多药耐药性的主要机制之一就是ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白的过量表达，它们可由ATP水解供能来将抗癌药物泵出细胞外。它主要的家族成员包括ABCB1(P-GP)、ABCC1(MRP1)和ABCG2(BCRP)等。细胞中ABCG2的高表达将会导致多药耐药的发生从而使治疗失败，因此抑制或消除ABCG2的表达能够有效的解决在肿瘤治疗中出现的多药耐药问题。
技术实现思路
为了克服某些高表达ABCG2蛋白的细胞出现多耐药的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列。该sgRNA导向序列可以用于敲除人ABCG2基因，进而抑制或消除ABCG2的表达。本专利技术的另一目的在于提供一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCG2基因的方法。该方法采用CRISPR-Cas9技术对ABCG2基因进行编辑，使其正常序列发生缺失或者突变从而达到敲除该基因的目的。本专利技术的再一目的在于提供上述特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列，为Sg1；其核苷酸序列为：Sg1：5'-GCTGCAAGGAAAGATCCAAG-3'，位于基因ABCG2第三个外显子；一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCG2基因的方法，包含如下步骤：(1)在上述导向序列的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在其5'端加上AAAC和其3'端加上C得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；(2)将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；(3)将步骤(2)制得的重组敲除表达载体与包装系统共转染包装细胞，然后收获病毒纯化并浓缩，得到病毒颗粒；(4)将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳转细胞，得到成功敲除ABCG2基因的细胞。步骤(2)中所述的Cas9载体优选为lentiCRISPRv2载体；步骤(3)中所述的包装细胞优选为293T细胞；步骤(3)中所述的包装系统中的包装载体优选为pMD2.G和psPAX2；步骤(4)中所述的细胞优选为肿瘤多药耐药性细胞；步骤(4)中所述的细胞进一步优选为S1M1-80；所述的特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列在制备抗肿瘤多药耐药性药物中的应用；所述的肿瘤优选为人结直肠癌；本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：(1)本专利技术根据sgRNA导向序列设计合成两条单链oligo序列，退火形成双链，然后与Cas9载体连接，利用Cas9载体将sgRNA以及CRISPR系统引入目标细胞中，Cas9蛋白会在sgRNA的引导下找到与其匹配的DNA序列，进行剪切，实现ABCG2基因的敲除。(2)载体中含有Puromycin抗性基因，利用Puromycin对细胞进行筛选，未转入lentiCRISPRv2载体的细胞将在筛选过程中被淘汰。(3)本专利技术提供的特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列，可通过CRISPR-Cas9系统敲除或编辑ABCG2基因，进而抑制或消除ABCG2的表达能够有效的解决在肿瘤治疗中出现的多药耐药问题。附图说明图1是特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列的序列及其位置示意图。图2是应用本专利技术设计的sgRNA对高表达ABCG2的细胞株进行编辑后抽提细胞mRNA逆转录成cDNA后PCR而后进行测序与成功转染空载lentiCRISPRv2的细胞株进行对比的测序分析图。图3是实施例2PCR产物测序结果的测序峰图。图4是成功敲除ABCG2基因的细胞株的ABCG2蛋白表达量的western blot结果分析图。图5是Cisplatin、Doxorubicin和Mitoxantrone处理后，成功敲除ABCG2基因的细胞株的细胞活性结果分析图。图6是应用本专利技术设计的sgRNA对高表达ABCG2的细胞株进行编辑后的药物积累实验结果结果分析图。图7是实施例3药物积累实验的流式结果分析图。图8是实施例3药物积累实验流式结果的量化处理分析图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中所使用的细胞株均购自ATCC，lentiCRISPRv2载体购自Addgene，内切酶BsmBⅠ购自Biolabs，Polyetherimide(PEI)购自Ploysciences，Puromycin和Polybreen购自Sigma。实施例1(1)sgRNA设计根据人ABCG2基因的基因组序列(gene ID:9429)，设计1个靶向人ABCG2基因的sgRNA。20nt的寡核苷酸sgRNA导向序列为：Sg1：5'-GCTGCAAGGAAAGATCCAAG-3'(位于基因ABCG2第三个外显子)(图1)；在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(见表1中Sg1-F)；根据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在其5'端加上AAAC和其3'端加上C得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)(见表1中Sg1-R)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverse oligo成对变性，退火；退火后可以形成连入表达载体lentiCRISPRv2载体的双链，同时将设计好的gRNA靶点序列进行blast比对以排除非特异性的靶切位点，具体寡核苷酸序列见表1。表1 sgRNA导向序列的寡核苷酸序列Sequence(5'to 3')Sg1-FCACCGGCTGCAAGGAAAGATCCAAGSg1-RAAACCTTGGATCTTTCCTTGCAGCC(2)构建表达sgRNA的载体病毒载体l本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列，其特征在于：所述的特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列为Sg1，其核苷酸序列为：Sg1：5'‑GCTGCAAGGAAAGATCCAAG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列，其特征在于：所述的特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列为Sg1，其核苷酸序列为：Sg1：5'-GCTGCAAGGAAAGATCCAAG-3'。2.一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCG2基因的方法，其特征在于包含如下步骤：(1)在权利要求1所述的sgRNA导向序列的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在其5'端加上AAAC和其3'端加上C得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；(2)将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；(3)将步骤(2)制得的重组敲除表达载体与包装系统共转染包装细胞，然后收获病毒纯化并浓缩，得到病毒颗粒；(4)将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳转细胞，得到成功敲除ABCG2基因的细胞。3.根据权利要求2所述的利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：石智，陈耀，张文姬，魏梦宁，邱建阁，蒋起韦，杨阳，郑迪威，王昆，黄家荣，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44