本发明专利技术属于分子生物学与生物医学技术领域，具体的说，本发明专利技术涉及基于CRISPR/Cas9靶向敲除兔骨形态发生蛋白2(BMP2)基因的细胞模型及其应用。本发明专利技术根据CRISPR/Cas9的设计原则，在兔BMP2基因上3个靶向位点，合成相应的oligos，并且将其构建在px458载体上。在兔骨髓间充质干细胞中利用针对这3个靶点构建出的CRISPR/Cas9系统，可以有效的敲除兔BMP2基因，这一系统易于操作，兔BMP2基因敲除效率高。本发明专利技术公开的兔BMP2基因敲除细胞模型能极大地促进BMP2基因功能及信号通路的相关研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与生物医学
，具体涉及基于CRISPR/Cas9靶向敲除兔骨形态发生蛋白2(BMP2)基因的细胞模型及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中TypeII型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activatingcrRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospaceradjacentmotif)附近特异性剪切DNA双链，形成DSB(doublestrandbreak)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合(Non-HomologousEndJoiningNHEJ)DNA修复方式，另一种是同源重组修复(HomologyDirectedRepairHDR)方式。NHEJ修复方式可能产生碱基的插入或缺失，从而产生移码突变，或者也可能突变成终止密码子，这些突变形式都可以改变目的基因的开放阅读框；HDR方式需要一段与被剪切片段同源的模板片段来修复DSB，这种修复方式可以将被用来作为模板的同源片段的序列复制到目的基因中，所以可以利用这种修复方式将特定的基因片段引入到目的基因中。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)又名成骨蛋白(osteogenicproteins，OPs)，属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，1965年首次被发现并因其具有诱导骨形成的能力而得名。目前已知的BMPs数量已达30余种。成熟的BMPs是30-38kDa的蛋白，其作用通过BMPs受体与Smad蛋白磷酸化等信号传导途径而完成。BMPs可调节细胞增殖，分化及凋亡，尤其在胚胎机体发育过程中对组织器官形态发生，在成年机体生长过程中对组织器官形态的维持起重要作用。BMP最初是作为能够在体内诱导骨和软骨的形成的因子为人们所认识的，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。现在研究认为，它们参与调节许多种细胞的增殖、分化和凋亡的生物学过程。骨形态发生蛋白2(BMP-2)隶属于骨形态发生蛋白家族。BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子。BMP2作为TGF-β超家族成员之一，它的主要功能是参与调控多种基因的生理活性，除了能引起多种细胞的增值、分化和凋亡外，还参与组织的再生和修复，BMP2作为最主要的骨形成调控因子，参与正常骨代谢中的各个阶段。它能够增加造血细胞的数量，提高骨髓单个核细胞中CD34下拨的数量比例，从而加快骨髓造血系统的重建，BMP2还可能参与面神经损伤后早期应激反应级修复再生活动。近年来的研究发现BMP-2不仅能诱导成骨，而且还可以促进或抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。目前，BMP-2对恶性肿瘤细胞的增殖和转移的作用尚存在争议，可能与BMP-2的活性梯度和浓度，以及细胞内、外抑制剂有关。但是，作为当前肿瘤研究中的一个热点，通过对BMP-2的相关研究，将帮助了解BMP与恶性肿瘤发生和转移的关系，为今后的临床治疗肿瘤提供一个新的途径。目前，关于BMP-2的成骨机制已经较明确，其及其受体与相应的TGF-β配体和受体的密切关系使其与肿瘤发生及发展的关系越来越引起关注，但是其在肿瘤中的作用机制还没有完全明确。肿瘤的发生是一个多基因参与的、多因素介导的过程，BMP-2及其通路中的因子在肿瘤发生及发展中也是与别的因子或基因协同发挥作用的，该通路或许发挥着重要的作用，随着研究的进展，可以为临床治疗提供一个新的靶点。因此，利用CRISPR/Cas9系统开发出一种BMP2基因敲除细胞模型，对促进BMP2基因功能及信号通路的相关研究，尤其是在骨骼再生修复和肿瘤治疗的靶标的研究就用极其重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于将骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因敲除的CRISPR/Cas9系统，及其质粒载体，以及所得到的细胞模型。本专利技术应用CRISPR/Cas9技术敲除兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)BMP2基因，采用脂质体转染方法，实现了建立BMP2基因敲除的细胞模型。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是目前骨组织工程中应用最广泛的种子细胞，具有取材方便、对机体损伤少、与生物支架材料的粘附性能好、在体外培养具有较强的增值传代能力等优点。本专利技术公开的CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型，所述CRISPR/Cas9用于特异性靶向人TCAB1基因的gRNA在兔BMP2基因上的靶序列符合5’-N(20)-NGG3’或者5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，兔BMP2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在兔BMP2基因的靶向位点位于兔BMP2基因的外显子上。上述CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型，其特征在于：所述靶向位点如序列表SEQ ID NO.2序列所示。上述CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型，其特征在于：该细胞模型在制备抑制肿瘤的试剂中的应用。上述CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型，其特征在于：该细胞模型在制备促进骨骼生长的试剂中的应用。本专利技术建立的BMP2基因敲除细胞模型，对于研究BMP2基因在成骨机制已经较明确，其及其受体与相应的TGF-β配体和受体的密切关系使其与肿瘤发生及发展的关系提供了有力的工具，该细胞模型能极大地促进BMP2基因功能及信号通路的相关研究，尤其是在骨骼再生修复和肿瘤治疗的靶标的研究就用极其重要的作用。该细胞模型制备方法简单，成本低廉，具有良好的稳定性和可靠性。附图说明附图1为T7Endonuclease I酶切结果(其中1-3泳道为不同靶向位点PCR效果；4-6泳道为不同靶向位点酶切效果)；附图2为测序结果图。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1靶向兔BMP2基因的gRNA合成及载体构建1、靶向兔BMP2基因的gRNA的选择和设计在Genebank中找到兔BMP2基因的序列，在兔BMP2基因的第1外显子区域设计潜在靶位点。通过在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)及gRNA的设计原则，评估兔BMP2基因序列上得分较高的靶位点设计gRNA，靶位点序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3，并设计对应的寡核苷酸。2、靶向兔BMP2基因的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表达载体的构建将pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒(AddgeneplasmidID：48138，以下简称pSpCas9(BB))，用BbSI酶切，37℃水浴1小时后，1％的琼脂糖电泳，回收酶切产物(TAKARA胶回收试剂盒)。酶切体本文档来自技高网...
【技术保护点】
CRISPR‑Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型，所述CRISPR‑Cas9用于特异性靶向人TCAB1基因的gRNA在兔BMP2基因上的靶序列符合5’‑N(20)‑NGG3’或者5’‑CCN‑N(20)‑3’的序列排列规则，兔BMP2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在兔BMP2基因的靶向位点位于兔BMP2基因的外显子上。
【技术特征摘要】
1.CRISPR-Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型，所述CRISPR-Cas9用于特异性靶向人TCAB1基因的gRNA在兔BMP2基因上的靶序列符合5’-N(20)-NGG3’或者5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，兔BMP2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在兔BMP2基因的靶向位...
【专利技术属性】
技术研发人员：申友亮，朱同娥，张靖靖，李修敏，
申请(专利权)人：青岛市胶州中心医院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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