用于修饰所靶向基因座的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于修饰细胞中的一个或多个靶基因座的方法和组合物。此类方法包括提供包含第一多核苷酸的细胞，所述第一多核苷酸编码第一选择标记并有效连接至所述细胞中有活性的第一启动子，其中所述第一多核苷酸还包含第一核酸酶试剂的第一识别位点。向细胞中引入第一核酸酶试剂，其中所述第一核酸酶试剂在所述第一识别位点处诱导切口或双链断裂。进一步向细胞中引入包含第一插入多核苷酸的第一靶向载体，所述第一插入多核苷酸侧接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂与位于足够接近第一识别位点处的第一靶位点和第二靶位点相对应。然后鉴定在其基因组中包含在所述靶基因座处整合的所述第一插入多核苷酸的至少一个细胞。

Methods and compositions for modifying a targeted gene locus

The present invention provides methods and compositions for modifying one or more target gene loci in cells. The method includes providing a polynucleotide comprising a first cell, the first marker and polynucleotide for encoding the first connected to the first promoter activity of the cells, wherein the first polynucleotide also contains the first recognition sites the first nucleic acid enzyme reagent. A first nuclease reagent is introduced into a cell, wherein the first nuclease reagent induces an incision or double strand break at the first identification site. Further to the cell containing the first target into the first insertion of polynucleotide to the carrier, the first side is connected to a first insertion polynucleotide homologous arms and second homologous arms, the first homologous arm and second homologous arms corresponding to the first recognition site is located close enough to the first target sites and second target sites. At least one cell in the genome of the first inserted polynucleotide integrated in the genome of the target gene is identified.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于修饰所靶向基因座的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2014年6月6日提交的美国临时申请No.62/008,832以及2014年6月27日提交的美国临时申请No.62/017,916的权益，这两个美国临时申请均据此全文以引用的方式并入本文中。
所述方法和组合物涉及分子生物学领域。具体地讲，本专利技术提供了用于修饰细胞中所靶向基因座的方法和组合物。作为通过EFSWEB提交的文本文件通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为461003SEQLIST.TXT，创建日期为2015年6月5日，文件大小为5KB，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文中。
技术介绍
使用被特别设计成在基因组座位处添加、缺失或取代特定核酸序列的靶向载体进行的同源重组，是在细胞中实现所需基因组修饰的常用方法。可将被特别改造成在靶基因座处或其附近引入切口或双链断裂的核酸酶与靶向载体联合使用，以增强靶基因座处同源重组的效率。虽然通过同源重组进行靶向修饰的领域在过去二十年内已取得显著进展，但使用靶向载体实现可接受的靶向效率仍然存在困难。需要能够提高产生靶向修饰的功效和效率的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了用于修饰细胞中一个或多个靶基因座的方法和组合物。在一些实施例中，提供了用于修饰细胞中靶基因座的方法，所述方法包括：(a)提供包含靶基因座的细胞，所述靶基因座包含编码第一选择标记并有效连接至细胞中有活性的第一启动子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸还包含第一核酸酶试剂的第一识别位点，(b)向细胞中引入(i)第一核酸酶试剂，其中所述第一核酸酶试剂在第一识别位点处诱导切口或双链断裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向载体，所述第一插入多核苷酸侧接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂与位于足够接近第一识别位点处的第一靶位点和第二靶位点相对应；以及(c)鉴定包含在靶基因座处整合的第一插入多核苷酸的至少一个细胞。在一些实施例中，用于修饰细胞中的靶基因座的方法包括：(a)提供包含第一靶基因座的细胞，所述第一靶基因座包含编码第一选择标记并有效连接至第一启动子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸还包含第一核酸酶试剂的第一识别位点，(b)向细胞中引入：(i)编码第一核酸酶试剂并有效连接至细胞中有活性的启动子的一个或多个表达构建体，其中所述第一核酸酶试剂在第一多核苷酸中的第一识别位点处诱导切口或双链断裂，从而破坏第一选择标记的表达或活性；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向载体，所述第一插入多核苷酸包含编码第二选择标记并有效连接至第二启动子的第二多核苷酸，其中所述第一插入核酸侧接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂与位于第一靶基因座中的第一靶位点和第二靶位点相对应；以及(c)鉴定在第一靶基因座处包含第一插入核酸的修饰细胞，其中所述修饰细胞具有第二选择标记的活性，但不具有第一选择标记的活性，并且其中所述第一选择标记和第二选择标记不同。在一个实施例中，靶基因座位于细胞的基因组中。在另一个实施例中，靶基因座位于细胞中的载体中。在一个实施例中，第一识别位点处的切口或双链断裂破坏第一选择标记的活性。在又一个实施例中，鉴定步骤(c)包括在允许鉴定没有第一选择标记活性的细胞的条件下培养细胞。在一个实施例中，包含第一选择标记的第一多核苷酸侧接第一靶位点和第二靶位点。在一个实施例中，鉴定步骤(c)包括鉴定包含在第一靶位点和第二靶位点处整合的第一插入多核苷酸的至少一个细胞。在一个实施例中，第一插入多核苷酸包含：(a)第一目标多核苷酸；和(b)编码第二选择标记并有效连接至细胞中有活性的第二启动子的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含第二核酸酶试剂的第二识别位点。在一个实施例中，所述方法还包括(a)向包含在靶基因座处整合的第一插入多核苷酸的细胞中引入(i)第二核酸酶试剂，其中所述第二核酸酶试剂在第二识别位点处诱导切口或双链断裂；和(ii)包含第二插入多核苷酸的第二靶向载体，所述第二插入多核苷酸侧接第三同源臂和第四同源臂，所述第三同源臂和第四同源臂与位于足够接近第二识别位点处的第三靶位点和第四靶位点相对应；以及(b)鉴定包含在靶基因座处整合的第二插入多核苷酸的至少一个细胞。在一个实施例中，第二识别位点处的切口或双链断裂破坏第二选择标记的活性。在一个实施例中，鉴定步骤(b)包括在允许鉴定没有第二选择标记的活性的细胞的条件下培养细胞。在一个实施例中，包含第二选择性标记的第二多核苷酸侧接第三靶位点和第四靶位点。在一个实施例中，鉴定步骤(b)包括鉴定包含在第三靶位点和第四靶位点处整合的第二插入多核苷酸的至少一个细胞。在一个实施例中，第二插入多核苷酸包含：(a)第二目标多核苷酸；和(b)编码第三选择标记并有效连接至细胞中有活性的第三启动子的第三多核苷酸，其中所述第三多核苷酸包含第三核酸酶试剂的第三识别位点。在一个实施例中，第一核酸酶试剂与第二核酸酶试剂不同。在一个实施例中，第一选择标记与第二选择标记不同。在一个实施例中，第一核酸酶识别位点和第三核酸酶识别位点彼此相同并与第二核酸酶识别位点不同；并且第一核酸酶试剂和第三核酸酶试剂彼此相同并与第二核酸酶试剂不同。在一个实施例中，第一选择标记和第三选择标记相同。在一个实施例中，第一选择标记、第二选择标记或第三选择标记中的一者赋予对抗生素的抗性。在一个实施例中，抗生素包括G418、潮霉素、杀稻瘟菌素、新霉素或嘌呤霉素。在一个实施例中，第一选择标记、第二选择标记或第三选择标记中的一者有效连接至诱导型启动子，并且选择性标记的表达对细胞有毒性。在一个实施例中，第一选择标记、第二选择标记或第三选择标记包括次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或单纯性疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)。在一个实施例中，所述细胞为原核细胞。在一个实施例中，所述细胞为真核细胞。在一个实施例中，所述真核细胞为哺乳动物细胞。在一个实施例中，所述哺乳动物细胞为非人哺乳动物细胞。在一个实施例中，所述哺乳动物细胞来自啮齿动物。在一个实施例中，所述啮齿动物为大鼠或小鼠。在一个实施例中，所述细胞为多能细胞。在一个实施例中，所述哺乳动物细胞为人诱导性多能干(iPS)细胞。在一个实施例中，所述多能细胞为非人胚胎干(ES)细胞。在一个实施例中，所述多能细胞为小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。在一个实施例中，所述多能细胞为造血干细胞。在一个实施例中，所述多能细胞为神经元干细胞。在一个实施例中，所述哺乳动物细胞为人成纤维细胞。在一个实施例中，与单独使用第一靶向载体相比，联合使用第一靶向载体与第一核酸酶试剂会提高靶向效率。在一个实施例中，与单独使用第一靶向载体相比，第一靶向载体的靶向效率提高了至少2倍。在一个实施例中，第一核酸酶试剂或第二核酸酶试剂包括表达构建体，所述表达构建体包含编码核酸酶试剂的核酸序列，并且其中所述核酸有效连接至细胞中有活性的第四启动子。在一个实施例中，第一核酸酶试剂或第二核酸酶试剂为编码核酸酶的mRNA。在一个实施例中，第一核酸酶试剂或第二核酸酶试剂为锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施例中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于修饰细胞中的靶基因座的方法，包括：(a)提供包含第一靶基因座的细胞，所述第一靶基因座包含编码第一选择标记并有效连接至第一启动子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸还包含第一核酸酶试剂的第一识别位点，(b)向所述细胞中引入：(i)编码第一核酸酶试剂并有效连接至所述细胞中有活性的启动子的一个或多个表达构建体，其中所述第一核酸酶试剂在所述第一多核苷酸中的第一识别位点处诱导切口或双链断裂，从而破坏所述第一选择标记的表达或活性；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向载体，所述第一插入多核苷酸包含编码第二选择标记并有效连接至第二启动子的第二多核苷酸，其中所述第一插入核酸侧接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂与位于所述第一靶基因座中的第一靶位点和第二靶位点相对应；以及，(c)鉴定在所述第一靶基因座处包含所述第一插入核酸的修饰细胞，其中所述修饰细胞具有所述第二选择标记的活性，但不具有所述第一选择标记的活性，并且其中所述第一选择标记和所述第二选择标记不同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 US 62/008,832;2014.06.27 US 62/017,9161.一种用于修饰细胞中的靶基因座的方法，包括：(a)提供包含第一靶基因座的细胞，所述第一靶基因座包含编码第一选择标记并有效连接至第一启动子的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸还包含第一核酸酶试剂的第一识别位点，(b)向所述细胞中引入：(i)编码第一核酸酶试剂并有效连接至所述细胞中有活性的启动子的一个或多个表达构建体，其中所述第一核酸酶试剂在所述第一多核苷酸中的第一识别位点处诱导切口或双链断裂，从而破坏所述第一选择标记的表达或活性；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向载体，所述第一插入多核苷酸包含编码第二选择标记并有效连接至第二启动子的第二多核苷酸，其中所述第一插入核酸侧接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂与位于所述第一靶基因座中的第一靶位点和第二靶位点相对应；以及，(c)鉴定在所述第一靶基因座处包含所述第一插入核酸的修饰细胞，其中所述修饰细胞具有所述第二选择标记的活性，但不具有所述第一选择标记的活性，并且其中所述第一选择标记和所述第二选择标记不同。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因座位于所述细胞的基因组中。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因座位于所述细胞中的载体中。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述鉴定步骤(c)包括在允许鉴定没有所述第一选择标记的活性的细胞的条件下培养所述细胞。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述鉴定步骤(c)包括鉴定包含在所述第一靶位点和所述第二靶位点处整合的所述第一插入多核苷酸的至少一个细胞。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一插入多核苷酸还包含第一目标多核苷酸。7.根据权利要求6所述的方法，其中编码所述第二选择标记的所述第二多核苷酸有效连接至所述细胞中有活性的第二启动子，并且其中所述第二多核苷酸包含第二核酸酶试剂的第二识别位点。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括(a)向包含在所述靶基因座处整合的所述第一插入多核苷酸的所述细胞中引入：(i)第二核酸酶试剂，其中所述第二核酸酶试剂在所述第二多核苷酸中的所述第二识别位点处诱导切口或双链断裂，从而破坏所述第二选择标记的表达或活性；和(ii)包含第二插入多核苷酸的第二靶向载体，所述第二插入多核苷酸侧接第三同源臂和第四同源臂，所述第三同源臂和所述第四同源臂与位于足够接近所述第二识别位点处的第三靶位点和第四靶位点相对应；以及(b)鉴定包含在所述靶基因座处整合的所述第二插入多核苷酸的至少一个细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述鉴定步骤(b)包括在允许鉴定没有所述第二选择标记的活性的细胞的条件下培养所述细胞。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中包含所述第二选择性标记的所述第二多核苷酸侧接所述第三靶位点和所述第四靶位点。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述鉴定步骤(b)包括鉴定包含在所述第三靶位点和所述第四靶位点处整合的所述第二插入多核苷酸的至少一个细胞。12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述第二插入多核苷酸包括：(a)第二目标多核苷酸；和(b)编码第三选择标记并有效连接至所述细胞中有活性的第三启动子的第三多核苷酸，其中所述第三多核苷酸包含第三核酸酶试剂的第三识别位点。13.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶试剂与所述第二核酸酶试剂不同。14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述第一选择标记与所述第二选择标记不同。15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一核酸酶识别位点和所述第三核酸酶识别位点彼此相同并与所述第二核酸酶识别位点不同；并且所述第一核酸酶试剂和所述第三核酸酶试剂彼此相同并与所述第二核酸酶试剂不同。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一选择标记和所述第三选择标记相同。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第一选择标记、所述第二选择标记或所述第三选择标记中的一者赋予对抗生素的抗性。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗生素包括G418、潮霉素、杀稻瘟菌素、新霉素或嘌呤霉素。19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第一选择标记、所述第二选择标记或所述第三选择标记中的一者有效连接至诱导型启动子，并且所述选择性标记的表达对所述细胞有毒性。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一选择标记、所述第二选择标记或所述第三选择标记包括次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或单纯性疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)。21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述细胞为原核细胞。22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为非人哺乳动物细胞。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞来自啮齿动物。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述细胞为多能细胞。28.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人诱导性多能干(iPS)细胞。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述多能细胞为非人胚胎干(ES)细胞。30.根据权利要求27所述的方法，其中所述多能细胞为小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述多能细胞为造血干细胞。32.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述多能细胞为神经元干细胞。33.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人成纤维细胞。34.根据权利要求1所述的方法，其中与单独使用所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：沃基特克·奥尔巴赫，大卫·弗伦杜威，古斯塔沃·德罗格特，安东尼·加戈利亚地，琼科·库诺，大卫·M·巴伦苏埃拉，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US