本发明专利技术公开了一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米碳量子点载体CQDs—PEG—Tf及其制备方法，以及以该载体介导抗肿瘤药物联合免疫细胞在肿瘤靶向治疗中的应用。体外实验结果表明该载体能与肿瘤细胞表面过表达受体特异性结合，且利用该载体介导抗肿瘤药物一定浓度下对免疫细胞具有良好的生物安全性。所述载体负载抗肿瘤药物与免疫细胞联合作用可双重靶向和杀伤肿瘤细胞，在实现双重抗肿瘤效应的同时又能降低抗肿瘤药物对正常细胞的毒副作用。该载体制备方法简单、易于实施，且具有高度靶向性、无毒性、优异的生物相容性以及可生物降解性。本发明专利技术可适用于靶向抗肿瘤药物的制备以及辅助免疫细胞对多种癌症疾病的靶向治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，具体涉及一种碳量子点纳米靶向载体及其制备方法以及靶向抗肿瘤药物的制备和该靶向抗肿瘤药物联合免疫细胞在肿瘤靶向治疗中的应用。技术背景当前，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者手术、放疗和化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好的效果。研究表明，免疫细胞具有杀灭肿瘤细胞和提高抗肿瘤免疫的双重作用，其可趋化和识别肿瘤细胞，并对肿瘤细胞、肿瘤干细胞和其它处于非增殖期的肿瘤细胞均具有明显的杀伤作用，同时还能提高机体的免疫力。免疫细胞疗法，其治疗效果显著，无明显副作用，与现代手术、化疗和放疗方法联合应用，可有效清除体内不同部位的微小残留病灶，防止肿瘤转移和复发。然而这种联合应用方法也并不能全部杀死肿瘤细胞，也存在不足之处。首先，每个人的肿瘤细胞不一定可以被这些免疫系统所识别，即使识别了很快又被肿瘤细胞所逃避。其次，目前肿瘤化疗方法对患者身体损伤很大，其化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤正常的组织器官，具有很大的毒副作用。最后，大部分抗癌药物是通过损伤细胞核内DNA杀死癌细胞，因此，其作用靶点位于癌细胞的细胞核中，然而由于细胞核的屏蔽作用，细胞质中的药物分子只有少量能进入细胞核，这大大降低了药物分子在肿瘤细胞的浓度。另外，肿瘤细胞对化疗药物易产生耐药性，导致了细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒性逐渐减弱甚至丧失。因此，亟需开发新型的集药物治疗效果好与毒副作用小于一体的药物治疗体系。研究表明纳米微粒能跨越血脑屏障，实现药物的传递，利用其作为药物载体不仅能保护药物的活性，还能实现缓释、控释和靶向释药的目的。近年来，石墨烯、磁性纳米颗粒、碳纳米管和富勒烯等纳米材料作为药物载体在生物医学中的应用获得了一定进展，但这些材料均存在生物相容性、毒副作用、制备复杂等问题而限制其在临床上的应用。最近，一种新型的碳纳米材料——碳量子点，由于
其具有荧光可示踪、良好的生物相容性、低毒性、分子量和粒径小、荧光稳定性高、表面易功能化等优点而被广泛应用于细胞标记、生物成像和靶向治疗等方面的生命科学领域。研究表明，在血液循环中的纳米颗粒易于通过肿瘤新生血管壁的缝隙聚集到肿瘤附近，即肿瘤血管具有的高渗透高阻溜效应(EPR效应)，故纳米载药颗粒本身具有被动靶向。若在纳米载药颗粒表面修饰上靶向分子，聚集到肿瘤组织附近的纳米载药颗粒可以进一步通过靶向分子与癌细胞表面的受体的特异性作用，可增强癌细胞对药物的摄取，减小药物对正常细胞的毒性，即赋予纳米颗粒主动靶向的功能。由于肿瘤的快速成长，需要补充大量的铁，导致大多数癌细胞表面转铁蛋白受体(TfR)的表达量高于正常细胞。研究表明在肿瘤细胞上转铁蛋白受体表达量是正常细胞2-7倍，转铁蛋白与其受体的亲和力是正常细胞的10-100倍。因此，转铁蛋白(Tf)可作为一理想的靶向分子修饰到纳米颗粒表面。转铁蛋白是一种单链糖基化β-球蛋白，其分子量约80KDa，主要负责脊椎动物体内Fe3+的结合和运输，是目前研究最多的活性药物靶向载体。目前，大量的研究已证实以Tf作为靶向载体，经Tf-TfR路径介导的药物输送体系可将药物运送至肿瘤细胞用于癌症的治疗。基于此，利用转铁蛋白与碳量子点偶联介导抗肿瘤药物，联合免疫细胞的肿瘤趋化作用及肿瘤杀谱广特性可实现特异性与非特异性的双重杀伤肿瘤细胞的作用。
技术实现思路
为了克服上述免疫细胞疗法不能全部识别肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的不足以及现有抗肿瘤药物用药剂量高、体内半衰期短、对正常细胞毒副作用大的缺点和对肿瘤细胞缺乏特异性的不足，本专利技术的首要目的在于提供一种辅助免疫细胞疗法实现高效双重杀伤肿瘤细胞的主动靶向性碳量子点纳米载药体系及其制备方法。本专利技术的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，所述的靶向纳米载药体系是以纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs—PEG—Tf，其中每毫克CQDs—PEG偶联转铁蛋白的含量为282-316微克，其粒径大小为224.5±90.2nm。本专利技术的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，包括如下步骤：1)将抗坏血酸溶于水中，搅拌均匀后，加入PEG搅拌，微波反应，将所得溶液过滤、洗涤和纯化后，即得碳量子点水溶液；所得的碳量子点水溶液除去过量的溶剂，干燥，得到碳量子点，粒径为7.32±0.98nm；2)取步骤1)所得干燥碳量子点，按比例加入无水N,N二甲基甲酰胺DMF和二氯亚砜SOCl2，搅拌反应，反应结束旋除去过量的SOCl2，得到酰氯化的碳量子点；3)取步骤2)所得酰氯化的碳量子点,按比例加入无水DMF中，并按比例加入聚乙二醇和三乙胺，搅拌反应；离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—OH，并烘干；4)取步骤3)所得干燥碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—OH中按比例加入无水DMF形成悬浊液后，按质量比加入琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP，搅拌反应；离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—COOH，并烘干；5)取步骤4)所得干燥沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—COOH按比例加入至硼酸缓冲溶液，形成悬浊液后，按比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC，常温下搅拌反应；反应液中按质量比加入转铁蛋白Tf，摇匀过夜，离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白CQDs—PEG—Tf。所述步骤1)中，抗坏血酸在反应液中的浓度为0.03g/ml，PEG在反应液中的的体积百分数为66.7％；透析袋截留分子量为8000；微波功率200～400W，设定温度60～100℃，微波作用时间80～200秒。所述步骤2)中，无水N,N二甲基甲酰胺(DMF)溶剂的体积与碳量子点的质量比为(0.1-0.2)mL：1mg，二氯亚砜(SOCl2)的体积与碳量子点的质量比为(0.4-0.6)mL：1mg，反应温度为65-70℃。所述步骤3)中，无水DMF的体积与碳量子点的质量比为(0.5-0.8)mL：1mg；聚乙二醇与碳量子点的质量比为(2-2.5)：1；三乙胺的体积与酰氯化碳量子点的质量比为(0.05-0.1)mL：1mg，反应温度为100℃。所述步骤4)中，无水DMF的体积与CQDs—PEG—OH的质量比为(2.0-3.0)mL：1mg，CQDs—PEG—OH、琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP质量比
为1：(2-2.5)：(2-2.5)，反应温度为100℃。所述步骤5)中，硼酸缓冲溶液的体积与CQDs—PEG—COOH的质量比为(0.4-0.6)mL：1mg，硼酸缓冲溶液pH为8.0；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC与CQDs—PEG—COOH的质量比为(2.2-2.5)：1，所用的转铁蛋白Tf的分子量为80kDa，CQDs—PEG—COOH与转铁蛋白的质量比1:(0.3-1)。含有辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的免疫细胞—CQDs—PEG—Tf复合物，采用如下制备方法制成：首先按照每种类型的免疫细胞的标准培养方法对免疫细胞进行体外培养、诱导、扩增获得免疫细胞，在获得的免本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，其特征在于：所述的靶向纳米载药体系是以纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs—PEG—Tf，其中每毫克CQDs—PEG偶联转铁蛋白的含量为282‑316微克，其粒径大小为224.5±90.2nm。
【技术特征摘要】
1.一种辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系，其特征在于：所述的靶向纳米载药体系是以纳米材料碳量子点CQDs为载体，聚乙二醇PEG为交联物，转铁蛋白Tf为靶向分子，通过共价偶联形成的靶向纳米载体CQDs—PEG—Tf，其中每毫克CQDs—PEG偶联转铁蛋白的含量为282-316微克，其粒径大小为224.5±90.2nm。2.如权利要求书1所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将抗坏血酸溶于水中，搅拌均匀后，加入PEG搅拌，微波反应，将所得溶液过滤、洗涤和纯化后，即得碳量子点水溶液；所得的碳量子点水溶液除去过量的溶剂，干燥，得到碳量子点，粒径为7.32±0.98nm；2)取步骤1)所得干燥碳量子点，按比例加入无水N,N二甲基甲酰胺DMF和二氯亚砜SOCl2，搅拌反应，反应结束旋除去过量的SOCl2，得到酰氯化的碳量子点；3)取步骤2)所得酰氯化的碳量子点,按比例加入无水DMF中，并按比例加入聚乙二醇和三乙胺，搅拌反应；离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—OH，并烘干；4)取步骤3)所得干燥碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—OH中按比例加入无水DMF形成悬浊液后，按质量比加入琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP，搅拌反应；离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—COOH，并烘干；5)取步骤4)所得干燥沉积物碳量子点-聚乙二醇CQDs—PEG—COOH按比例加入至硼酸缓冲溶液，形成悬浊液后，按比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC，常温下搅拌反应；反应液中按质量比加入转铁蛋白Tf，摇匀过夜，离心，除去上清液，得沉积物碳量子点-聚乙二醇-转铁蛋白CQDs—PEG—Tf。3.根据权利要求书2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，抗坏血酸在反应液中的浓度为0.03g/ml，PEG在反应液中的的体积百分数为66.7％；透析袋截留分子量为8000；微波功
\t率200～400W，设定温度60～100℃，微波作用时间80～200秒。4.根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，无水N,N二甲基甲酰胺(DMF)溶剂的体积与碳量子点的质量比为(0.1-0.2)mL：1mg，二氯亚砜(SOCl2)的体积与碳量子点的质量比为(0.4-0.6)mL：1mg，反应温度为65-70℃。5.根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，无水DMF的体积与碳量子点的质量比为(0.5-0.8)mL：1mg；聚乙二醇与碳量子点的质量比为(2-2.5)：1；三乙胺的体积与酰氯化碳量子点的质量比为(0.05-0.1)mL：1mg，反应温度为100℃。6.根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，无水DMF的体积与CQDs—PEG—OH的质量比为(2.0-3.0)mL：1mg，CQDs—PEG—OH、琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP质量比为1：(2-2.5)：(2-2.5)，反应温度为100℃。7.根据权利要求2所述的辅助免疫细胞疗法的靶向纳米载药...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐妍，陈蕾，郭世磊，
申请(专利权)人：徐妍，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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