供植物中基因靶向用的工程化降落场制造技术

本发明专利技术涉及供植物中基因靶向用的工程化降落场，具体地涉及一种用于生成转基因植物的方法包括提供包含与植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的至少两个核酸序列区和至少两个锌指核酸酶识别位点的核酸分子，其中与植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的至少两个核酸序列区在至少两个锌指核酸酶识别位点侧翼。转化具有稳定整合入植物细胞的基因组中的核酸分子的植物细胞或组织。自植物细胞再生植物。通过所述方法生成转基因植物。通过转基因植物生成种子。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术申请是基于申请日为2011年1月21日，申请号为201180015548.8(国际申请号为PCT/US2011/022145)，名称为“供植物中基因靶向用的工程化降落场”的专利技术专利申请的分案申请。优先权要求本申请要求2010年1月22日提交的美国临时专利申请流水号61/297,641关于“ENGINEEREDLANDINGPADSFORGENETARGETINGINPLANTS”的提交日的权益。专利
一般地，本专利技术涉及用于生成转基因生物体，例如植物的组合物和方法。在某些实施方案中，本专利技术的方法容许将工程化降落场(engineeredlandingpad,ELP)掺入基因组位点中，由此便于将其它感兴趣的核酸分子导入含有一个或多个ELP的限定基因组位点中。在一些实施方案中，ELP可以包含含有在锌指核酸酶(ZFN)结合位点侧翼的基本上随机的序列的核苷酸序列区。专利技术背景许多植物用来自其它物种的基因遗传转化以导入期望的性状，诸如以经由例如改善营养价值质量、提高产量、赋予有害物或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量诸如色素沉着和生长、和/或赋予除草剂抗性；实现自植物生成工业上有用的化合物和/或材料；和/或实现药物的生成来改善农业价值。克隆基因对植物细胞的导入和稳定的能育转基因植物的回收可以用于进行植物的此类修饰，并且已经容许植物的遗传工程(例如用于作物改良)。在这些方法中，通常将外来DNA随机导入真核植物细胞的核或质体DNA中，接着分离含有整合入细胞的DNA中的外来DNA的细胞，以生成经稳定转化的植物细胞。第一代转基因植物通常通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化技术生成。用这些技术获得的成功激励开发将感兴趣的核酸分子导入植物基因组中的其它方法，诸如原生质体中PEG介导的DNA摄取、微粒轰击、和硅须晶(whisker)介导的转化。然而，在所有这些植物转化方法中，掺入植物基因组中的转基因以随机方式且以不可预测的拷贝数整合。通常，转基因可以以整个转基因或其部分的重复形式整合。此类复杂的整合样式可以影响转基因的表达水平(例如，通过经由转录后基因沉默机制破坏转录的RNA，或者通过诱导对导入DNA的甲基化实现)，由此下调转基因的转录。还有，整合位点本身可以影响转基因的表达水平。这些因素的组合导致感兴趣的转基因或外来DNA在不同转基因植物细胞和植物系间的表达水平的广泛变化。此外，感兴趣的外来DNA的整合可以对基因组中发生整合的区域具有破坏性影响，而且可以影响或扰乱所述靶区域的正常功能，由此经常导致不想要的副作用。以上需要无论何时调查将特定外来DNA导入植物中的影响，生成并分析大量转基因植物系以获得显著的结果。同样地，在转基因作物植物的世代中，在植物中导入感兴趣的特定DNA以提供具有期望表型的转基因植物的情况中，创建独立创建的转基因植物系的大群体以容许选择具有最佳转基因表达，且对转基因植物的总体表型具有最小或无副作用的那些植物系。特别在此领域中，例如鉴于繁琐的管理要求和与消除不想要的转基因事件需要的重复田间试验有关的高成本，更定向的转基因方法是期望的。此外，会清楚的是，靶向性DNA插入的可能性在转基因叠加过程中也会是有益的。已开发出几种方法以控制植物中的转基因插入。见例如Kumar和Fladung(2001)TrendsPlantSci.6:155-9。这些方法依赖于基于同源重组的转基因整合。此策略已经在原核生物和低等真核生物中成功应用。Paszkowski等(1988)EMBOJ.7:4021-6。然而，对于植物，直到最近，转基因整合的主要机制基于非常规重组，其牵涉重组DNA链间很少的同源性。因此，此领域中的主要挑战是检测罕见的同源重组事件，其被经由非常规重组有效得多地整合导入的外来DNA掩盖。定制设计的锌指核酸酶(ZFN)是为了提供DNA中靶定位点特异性双链断裂，随后重组切割末端设计的蛋白质。ZFN组合限制性内切核酸酶，诸如例如FokI的非特异性切割域与锌指DNA结合蛋白。见例如Huang等(1996)J.ProteinChem.15:481-9；Kim等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3616-20；Kim等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1156-60；Kim等(1994)ProcNatl.Acad.Sci.USA91:883-7；Kim等(1997b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:12875-9；Kim等(1997c)Gene203:43-9；Kim等(1998)Biol.Chem.379:489-95；Nahon和Raveh(1998)NucleicAcidsRes.26:1233-9；Smith等(1999)NucleicAcidsRes.27:674-81。各个锌指基序可以设计为靶向并结合大范围的DNA位点。规范的Cys2His2及非规范的Cys3His锌指蛋白通过将α-螺旋插入双螺旋的大沟中结合DNA。锌指对DNA的识别是模块的：每个指主要接触靶物中的三个连续的碱基对，并且蛋白质中的几个关键残基介导识别。已经显示了FokI限制性内切核酸酶必须经由核酸酶域二聚化以切割DNA，诱导双链断裂。类似地，ZFN也需要核酸酶域的二聚化以切割DNA。Mani等(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191-7；Smith等(2000)NucleicAcidsRes.28:3361-9。ZFN的二聚化由两个相邻的、相反取向的结合位点促进。同上文。专利技术概述本文中公开了将核酸分子导入展现出低同源重组率的宿主生物体，例如，植物或动物物种的基因组中的方法。在具体的例子中，使用“工程化降落场”(ELP)，其中ELP可以包含如下的核苷酸序列区，其包含在DNA结合域(例如，锌指蛋白(ZFP)、大范围核酸酶、或亮氨酸拉链)的结合位点侧翼的与宿主生物体的基因组基本上缺乏同源性的核苷酸序列(例如，随机生成的序列)。靶向ELP的结合位点的DNA结合域可以天然地包含DNA切割功能域或者可以是融合蛋白中进一步包含功能域，例如内切核酸酶切割域或切割半域(例如，ZFN、重组酶、转座酶、或归巢内切核酸酶，包括具有经修饰的DNA结合域的归巢内切核酸酶)的部分。此类DNA结合和切割蛋白在本文中统称为“靶向性内切核酸酶”。在具体的例子中，也可以使用来自与宿主生物体不同的生物来源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程化降落场(ELP)，其包含：具有式X1‑Y‑X2的核苷酸分子，其中Y包含至少一个靶向性内切核酸酶结合位点，其中X1是与宿主生物体的基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列，并且位于Y的5’，且其中X2是与X1不同的与宿主生物体基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2010.01.22 US 61/297,6411.一种工程化降落场(ELP)，其包含：
具有式X1-Y-X2的核苷酸分子，
其中Y包含至少一个靶向性内切核酸酶结合位点，
其中X1是与宿主生物体的基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列，并且位
于Y的5’，且
其中X2是与X1不同的与宿主生物体基因组缺乏同源性的选定核苷酸序
列。
2.权利要求1的ELP，其中所述至少一个靶向性内切核酸酶结合位点包
含锌指核酸酶(ZFN)结合位点。
3.权利要求1的ELP，其中所述核酸分子还包含不同限制性位点。
4.权利要求2的ELP，其中所述不同限制性位点包含相容的单链末端，
其容许多个ELP的连环化。
5.权利要求1的ELP，其中所述与宿主生物体的基因组缺乏序列同源性
的选定核苷酸序列是约50bp至约3kb。
6.权利要求1的ELP，其中所述ELP在每个末端侧翼有一个或多个靶向
性内切核酸酶识别位点。
7.权利要求1的ELP，其中所述ELP在每个末端侧翼有一个或多个限制
酶位点。
8.权利要求7的ELP，其中所述一个或多个限制酶位点包含FseI限制酶位
点。
9.权利要求8的ELP，所述一个或多个限制酶位点包含在FseI限制酶位点
内部的BglII和BamHI位点。
10.权利要求1的ELP，其中X1包...

【专利技术属性】
技术研发人员：WM安利，RC布鲁，MG莫雷，DR科宾，RR迈尔斯，SR韦布，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US