本发明专利技术公开一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将胆碱脱氢酶基因betA和磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP和pCAMBIA1300‑betA‑als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐耐旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质。本发明专利技术方法建立了以磷酸乙醇胺为原料合成甘氨酸甜菜碱的代谢途径，实验证实转基因后的棉花耐盐抗旱特性显著提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，属植物基因工程领域。
技术介绍
土壤盐渍化、干旱是农业粮食生产中的主要威胁因素之一。由于植物固着生长在环境中而不能自主移动，为了应对诸如温度、盐碱、干旱、重金属等胁迫，植物存在着多种应对机制来适应多样性的非生物胁迫。在众多应对干旱、高盐胁迫的机制中，一个重要的策略就是细胞合成相容性化合物以帮助植物自身在干旱、高盐胁迫下生存。合成的这些物质由于它们易溶于水、甚至在较高浓度下对植物也不会造成不良的影响而被称为相容的化合物(RhodesD&HansonAD.Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.,1993,44:357-384)。甜菜碱是生物相容性物质中较为优秀的一种(Razaetal.PlantBiotechnolRep,2013,7:49-57)。甘氨酸甜菜碱(甜菜碱)是一种两性化合物，它在很宽的生理pH范围内保持电中性，极易溶于水，并具有三个甲基组成的非极性部分。甜菜碱在植物处于非生物逆境胁迫下在渗透调节作用、稳定和保护生物大分子的结构和功能、保护膜的完整性、对光合系统的保护作用、诱导特定基因的表达等诸多方面对植物保护发挥作用(Razaetal.PlantBiotechnolRep,2013,7:49-57)。许多植物能够在细胞内积累高水平甜菜碱来响应非生物胁迫，甜菜碱的积累水平通常与植物的胁迫抗性程度一致(Rhodesetal.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.1993,44:357–384.)。此外，外施甜菜碱也能够提高多种植物对各种非生物胁迫的耐受性，还能使长势增强和增加产量(Chenetal.TrendsPlantSci.2008,13(9):499-505；Ahmetetal.SciHortic,2012,(148):197-205；Shanetal.PostharvestBiolTech,2016,114:104-110.)。自然界中已发现的甜菜碱合成途径按底物的不同可分两大类：一类是以胆碱为底物合成甜菜碱，另一类以甘氨酸为底物连续甲基化合成甜菜碱(Mohammad,etal.PlantBiotechnology,2009,26,125-134)。以胆碱为底物的甜菜碱合成途径根据参与合成途径的酶系统不同又可分为3种类型：一是在黎科和苋科等高等植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，先由胆碱单加氧酶(CMO)催化胆碱转化为甜菜碱醛，然后在甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化的作用下将甜菜碱醛转化为甜菜碱(Weretilnyketal,Planta,2009,178:342-352)；二是在微生物球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)和滋养节杆菌(A.pascens)中甜菜碱的合成仅需要一种酶即胆碱氧化酶(cholineoxidase,COD)催化胆碱转化甜菜碱，同时伴有H2O2产生(Ikutaetal.J.Biochem.(Tokyo),1977,82(6):1741-1749.)；三是在在大肠杆菌中，从胆碱到甜菜碱的转变由胆碱脱氢酶(cholinedehydrogenase，CDH)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase，BADH)催化完成，即由胆碱脱氢酶催化胆碱转化为甜菜碱醛，甜菜碱醛然后在甜菜碱醛脱氢酶催化的作用下生成甜菜碱。胆碱脱氢酶是一种依赖氧的膜结合黄素蛋白，不但能催化胆碱氧化为甜菜碱醛，而且能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛的氧化。甜菜碱醛脱氢酶是一种依赖于NAD的可溶性蛋白，对甜菜碱醛具有很高的亲合性。betA基因编码CDH，betB基因编码BADH(Landfaldetal,J.Bacteriol.,1986,165(3):849-855)。Quan等将来自于大肠杆菌的betA基因转入了玉米植株，在转基因植株中甜菜碱的积累量相对于非转基因对照增加了1.1-2.3倍，并且转基因玉米植株对低温和干旱胁迫的抗性比对照增强(Quanetal.PlantSci,2014,166:141-149；Quanetal.PlantBiotechnolJ,2014,2:477-486.)。将betA基因转入棉花，也提高了棉花的耐盐抗旱性(Lvetal.MolBreed,2007,20(3):233-248.Zhangetal.Euphytica,2011,181:1-16.)。胆碱作为甜菜碱合成的必要前体物质，在高等植物中可通过磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamineN-methyltransferase,PEAMT)催化磷酸乙醇胺连续甲基化途径而合成。磷酸乙醇胺甲基转移酶其功能是催化磷酸乙醇胺三次甲基化生成磷酸胆碱，其后磷酸胆碱在磷酸胆碱磷酸酶的水解作用下可生成胆碱和磷脂酸。胆碱在一些植物叶绿体基质中可通过胆碱单加氧酶(CMO)和甜菜碱脱氢酶(BADH)两步氧化催化最终生成甘氨酸甜菜碱。磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶参与的步骤是在胆碱生物合成的关键步骤一个控制点，是催化磷酸乙醇胺三次甲基化生成胆碱的限速酶(Scottetal,PNAS,2001,98:10001-1005)。将胆碱单加氧酶(CMO)基因转入烟草(Nicotianatabacum)、拟南芥、油菜(Brassicanapus)等植株中以期提高其抗盐性,但抗逆效果不明显。但加入外源的胆碱后转基因植株的甜菜碱含量明显增加,植物的抗性也显著的增强(Huangetal,PlantPhysiol,2000,122(3):747-756)。推测这可能是因为甜菜碱合成的前体物质胆碱的含量不足引起的，需要增加内源性胆碱供应以增强细胞中甜菜碱的积累(McNeiletal,PlantPhysiol,2000,123(1):371-380；Takaba.JPlantBiochBiot,2012,21(S1):58-62.)。而Mou等研究表明,拟南芥peamt突变体t365的胆碱生物合成量减少约64％,从而导致突变体植株对盐渍高度敏感，PEAMT基因具有促进甜菜碱的合成从而有助于提高植物抗盐的能力(PlantCell,2002,14(9):2031～2043)。在转基因烟草中甜菜碱没有大量积累的原因推测可能是外源基因的表达水平低，也可能是由于甜菜碱合成所需底物胆碱的供应受限所致。但在转基因烟草、拟南芥和油菜中发现，如果转基因植株能够获取外源胆碱，转基因植株中甜菜碱的积累量就会增加(Huang,etal..PlantPhysiol.,2000,122(3):747-756；Nuccio,etal.PlantJ.1998,16(4):487-496.)，因此这些转基因植物没有高浓度积累可能是由于甜菜碱合成所需底物胆碱的供应受限所致。将控制胆碱合成的关键酶磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(PEAMT)导入表达CMO和BADH的转基因烟草后，PEAMT基因的过表达使转基因烟草的磷酸胆碱和胆碱分别的含量分别增加了5倍和50倍，使甜菜碱的合成增加了约30倍，有效地提高了植株耐盐性,且不影响转基因株的正常生长。这表明了PEAMT基因可显著提高转基因植株体内本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自植物的磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP和植物表达载体pCAMBIA1300‑betA‑als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐抗旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质；其特征在于：所述构建重组植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP的方法是：(1)BamHI和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA1300‑EPSP，回收载体；BamHI和KpnI双酶切克隆载体pUC57‑GhPEAMT回收GhPEAMT片段；将回收的植物表达载体pCAMBIA1300‑EPSP的载体部分与回收的克隆载体pUC57‑GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT连接，获得中间植物表达载体，命名为pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP；(2)EcoRI酶切回收中间植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP的载体部分，通过引物用高保真DNA聚合酶从植物表达载体pCAMBIA1300‑betA‑als中扩增得到两端引入EcoRI酶切位点的片段35S‑betA‑nos并用EcoRI酶切后回收；将回收的中间植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP的载体部分与回收的35S‑betA‑nos片段连接，得到重组植物表达载体，命名为pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP；其中所述引物的核苷酸序列为：NOS‑B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；35S‑B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'；所述棉花细胞是茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体；所述利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体的方法是：通过对3～4叶期转基因棉花小苗喷洒1.6～1.8‰草甘膦检测转基因植株的抗性，用除草剂筛选获得抗性植株，然后对抗性植株利用PCR、southern杂交技术检测获得转基因纯合植株。...
【技术特征摘要】
1.一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自植物的磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP和植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐抗旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质；其特征在于：所述构建重组植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的方法是：(1)BamHI和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP，回收载体；BamHI和KpnI双酶切克隆载体pUC57-GhPEAMT回收GhPEAMT片段；将回收的植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP的载体部分与回收的克隆载体pUC57-GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT连接，获得中间植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP；(2)EcoRI酶切回收...
【专利技术属性】
技术研发人员：张可炜，宋玖玲，陈修贵，程成，张尚立，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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