本发明专利技术公开了一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；本发明专利技术方法利用同尾酶的特性，只需要通过一次PCR扩增获得一段DNA片段，对该片段酶切一次，可以简化构建流程，提高构建效率。同时，该方法构建的RNAi载体中形成发夹结构(目的片段‑内含子‑反向重复目的片段)的部分只需要两个同尾酶酶切位点，这样可以预留出更多的单克隆位点，提高载体构建的灵活性。利用本方法构建的RNAi载体可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种RNAi载体，特别涉及一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用。(二)
技术介绍
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由靶基因同源双链RNA引发的在动植物中普遍存在的序列特异性转录后基因沉默(Hannon,(2002)Nature,418:244-251)。最早在植物体中发现，现已成为后基因组时代的重要研究手段。RNAi在植物功能基因组、生长发育、抗病毒、品质改良等方面都有重要的应用价值。在植物中，RNAi一般是通过具有双链RNA(dsRNA)的发夹结构RNA(hairpin RNA(hpRNA))来实现的(Waterhouse and Helliwell,(2003)Nat Rev Genet,4:29-38)。虽然，反义RNA介导的基因沉默作为一种RNAi现象已经广泛应用于植物基因功能分析，hpRNA介导的RNAi具有更高的效率(Chuang and Meyerowitz,(2000)P Natl Acad Sci USA 97:4985-4990)。产生hpRNA的载体通常是从靶标基因上克隆到一组反向互补的核苷酸序列，这一组序列中间由一段无关的间隔序列连接，然后用强启动子驱动表达。启动子可以是35S CaMV(多用于双子叶植物)或者maize ubiquitin 1(多用于单子叶植物)。反向互补序列中间的无关的间隔序列最好是内含子(Intron)，这对反向重复序列在Escherichia coli中的稳定性以及在植物中的基因沉默效率的提高都十分重要(Smith et al.,(2000)Nature 407:319-320；Wesley et al.,(2001)Plant J 27:581-590)。上述产生hpRNA的载体稳定性和效率都比较高，但是载体构建起来也相对复杂，简单高效的产生hpRNA的载体构建方法亟待发现。同尾酶是指能酶切产生相同的粘性末端的限制性内切酶。常用的同尾酶包括：BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI等。这些同尾酶的特性可以用于简化产生hpRNA的RNAi载体的构建。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用，解决目前构建产生发夹RNA载体需要克隆多个目标片段(正向序列、反向序列、内含子)的技术问题。该方法只需要用PCR的方法克隆一个目的片段就可以构建出具有高干扰效率的RNAi载体。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种基于同尾酶构建的RNAi载体，所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；所述过渡载体中预置一个内含子和一个终止子，内含子的5’端依次设置同尾酶酶切位点A1、B1，3’端依次设置同尾酶酶切位点B2、A2，其中A1、A2为一组同尾酶酶切位点，B1、B2为另一组同尾酶酶切位点，字母本身没有含义，为了便于表述内含子两端设计的酶切位点来自两组同尾酶而命名；所述目的片段的5’端和3’端分别设置A1、B1或者A2、B2酶切位点；通过两次酶切、连接和转化反应，把目的片段分别连入内含子的5’端和3’端，形成“目的片段-内含子-反向重复目的片段-终止子”结构的DNA片段，再通过一次酶切、连接和转化反应把上述DNA片段连入预置有启动子的终载体中，或者DNA片段跟设计的启动子通过三段连接连入终载体，获得RNAi载体。进一步，所述同尾酶为下列之一：(1)BglII和BamHI，(2)NheI和XbaI，(3)SalI和XhoI。也可以是其它具有类似属性的限制性内切酶。进一步，所述内含子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。进一步，所述终止子核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。进一步，所述载体为pGEM-T easy Vector。进一步，所述终载体为双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10。进一步，所述基于同尾酶构建的RNAi载体构建方法为：(1)以pGEM-T easy Vector为骨架，把内含子和终止子连入该载体中，同时在内含子两端分别依次设置A1、B1和B2、A2酶切位点，形成过渡载体1；(2)对PCR扩增获得两端分别设置有A1、B1或者A2、B2酶切位点的目的基因进行酶切回收，获得目的片段；(3)然后用设置在目的基因上的两个同尾酶对过渡载体1进行酶切回收，获得载体；(4)把步骤(2)和步骤(3)回收的目的片段和载体连接、转化，获得含有一段目的基因的过渡载体2；(5)再用设置有同目的基因酶切位点的对应同尾酶对过渡载体2进行酶切回收，并与步骤(2)中回收的目的片段进行连接转化，获得具有“目的片段-内含子-反向重复目的片段”结构的过渡载体3；(6)最后将过渡载体3中的“目的片段-内含子-反向重复目的片段”结构连同终止子酶切回收后连入对应的终载体中，即获得RNAi载体。本专利技术还提供一种所述基于同尾酶构建的RNAi载体在基因转化中的应用。可以利用该方法构建产生发夹结构RNA的RNAi载体，通过转基因的方法导入植物或者动物细胞中，实现靶标基因的沉默。本专利技术还提供一种所述基于同尾酶构建的RNAi载体在制备转基因植物中的应用。可以利用该方法构建RNAi载体，通过转基因的方法导入植物细胞中，获得靶标基因被沉默的转基因植株。该方法可以用于基因功能的研究，也可以用于抑制和沉默靶标基因的表达，改良作物性状。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：与目前已有的产生hpRNA的RNAi载体构建方法相比，本专利技术方法利用同尾酶的特性，只需要通过一次PCR扩增获得一段DNA片段，对该片段酶切一次，可以简化构建流程，提高构建效率。同时，该方法构建的RNAi载体中形成发夹结构(目的片段-内含子-反向重复目的片段)的部分只需要两个同尾酶酶切位点，这样可以预留出更多的单克隆位点，提高载体构建的灵活性。利用本方法构建的RNAi载体可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。(四)附图说明图1：基于同尾酶的RNAi载体构建技术方案示意图。图2：pGEM-T-LOG-intron-Ter载体结构示意图。LOG-Intron为水稻LOG基因第二个内含子。LOG-Intron 5’端设置有4个酶切位点，分别为EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI，其中EcoRI、HindIII用于终载体构建，BamHI、XhoI分别为两组同尾酶中的一个，用于连接目的片段；3’端依次设置有SalI和BglII酶切位点，SalI和BglII分别为XhoI和BamHI的同尾酶。ApaI和SacI之间为人工合成的终止子Ter。图3：接入目的片段的RNAi终载体中产生发夹结构的RNA部分的结构示意图。p35S：35S启动子；F：靶向目的基因的目的片段；LOG-Intron：水稻LOG基因第二个内含子；R：靶向目的基因的目的片段的反向重复序列；Ter：人工合成的终止子。把片段R连入载体后，酶切位点SalI和XhoI，BglII和BamHI连接后被钝化。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、RNAi过渡载体构建水稻LOG基因(g本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；所述过渡载体中预置一个内含子和一个终止子，内含子的5’端依次设置同尾酶酶切位点A1、B1，3’端依次设置同尾酶酶切位点B2、A2，其中A1、A2为一组同尾酶酶切位点，B1、B2为另一组同尾酶酶切位点；所述目的片段的5’端和3’端分别设置A1、B1或者A2、B2酶切位点；通过两次酶切、连接和转化反应，把目的片段分别连入内含子的5’端和3’端，形成“目的片段‑内含子‑反向重复目的片段‑终止子”结构的DNA片段，再通过一次酶切、连接和转化反应把上述DNA片段连入预置有启动子的终载体中，或者DNA片段跟设计的启动子通过三段连接连入终载体，获得RNAi载体。
【技术特征摘要】
1.一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；所述过渡载体中预置一个内含子和一个终止子，内含子的5’端依次设置同尾酶酶切位点A1、B1，3’端依次设置同尾酶酶切位点B2、A2，其中A1、A2为一组同尾酶酶切位点，B1、B2为另一组同尾酶酶切位点；所述目的片段的5’端和3’端分别设置A1、B1或者A2、B2酶切位点；通过两次酶切、连接和转化反应，把目的片段分别连入内含子的5’端和3’端，形成“目的片段-内含子-反向重复目的片段-终止子”结构的DNA片段，再通过一次酶切、连接和转化反应把上述DNA片段连入预置有启动子的终载体中，或者DNA片段跟设计的启动子通过三段连接连入终载体，获得RNAi载体。2.如权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述同尾酶为下列之一：(1)BglII和BamHI，(2)NheI和XbaI，(3)SalI和XhoI。3.如权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述内含子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。4.如权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述终止子核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。5.如权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：张先文，王东芳，沈志成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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