一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法技术

本发明专利技术公开了一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法，该转基因培养基包括：二倍体草莓种子培养基S1、二倍体草莓共培养培养基S2、二倍体草莓筛选培养基S3；该转基因方法包括：(1)菌种活化，(2)二倍体草莓转基因；本发明专利技术建立了一个高效、快速、稳定二倍体草莓转化体系，外植体采用叶片和叶柄，将材料最大程度的应用，提高了提高二倍体草莓转基因转化效率，转化率可达到50％以上；并且能够解决传统农杆菌介导法中的步骤繁杂，容易污染的问题，为进一步应用遗传转化方法改良草莓品种提供实践基础，有利于今后草莓分子育种工作的发展，本发明专利技术转基因方法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程，具体涉及到一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法。
技术介绍
草莓是一种兼具营养价值和观赏价值的水果，近年来草莓栽培逐渐成为农民致富的首选。而选育品质优良，产量高的草莓品种也是草莓研究工作者的一项重要任务。随着近年来分子生物学和基因工程的飞速发展，研究热点转向草莓种质资源优良基因的深度挖掘，并进行分子标记和基因表达序列的鉴定和测定。同时在抗逆性、耐贮运、风味品质等遗传改良等方面的研究结果相继有所报道，草莓育种正朝着分子育种方向发展。而分子育种中最重要的手段是草莓的转基因。通常我们将草莓品种分为两大类，分别是八倍体的栽培草莓(Fragaria×ananassa，2n＝8x＝56)和二倍体野生草莓品种。栽培种常见的品种都属八倍体，而八倍体品种是高度杂合的，遗传背景复杂，因此在育种上周期长，不可控因素较多。野生的二倍体草莓品种‘Rugen’是育种中的一个优良材料，因其没有匍匐茎，可直接播种用于繁殖，而且该品种从播种到果实成熟只需要6个月时间，生长周期短，易于繁殖，因此是目前草莓研究工作者常用的品种。实现分子育种，首先需要建立高效稳定的转基因体系。目前常用的草莓基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是草莓转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟最常用的一种转基因方法。虽然草莓的转基因技术路线比较成熟，但是传统方法费事费力，耗时间长，操作繁琐而且效率很低，获得的转基因植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带来了障碍。传统的农杆菌介导法操作过程比较繁琐，在转基因的过程中容易出现许多问题，比如合适载体的选择、合适菌株的选择、杂菌的污染、农杆菌无法抑制、菌液浓度过高或者过低导致转基因不成功、侵染时间长短的控制等等，这些问题都会影响草莓转基因的效率以及速度，传统方法获得的二倍体草莓植株转基因效率不到百分之一。而目前报道的转基因体系多建立于八倍体草莓中，而对二倍体草莓转基因体系很少有相关研究。尤其是二倍体品种‘Rugen’的转基因体系目前还未见相关报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有问题，本专利技术提供一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法，本专利技术建立了一个高效、快速、稳定二倍体草莓转化体系，可以同时用叶柄和叶片来做外植体进行转基因，将材料最大程度的应用，并且能够直接、高效的解决传统农杆菌介导法中的步骤繁杂，容易污染的问题；解决二倍体草莓转化效率低的问题。技术方案：为了实现上述目的，本专利技术提供了一种二倍体草莓的转基因培养基，包括如下成分：二倍体草莓种子培养基S1：2.0-2.5g/L MS、15-25g/L蔗糖、0.2-0.5mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、5.0-6.0g/L琼脂粉，pH5.5-6.0；二倍体草莓共培养培养基S2：4.2-4.6g/LMS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.4mg/L ZT,、0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、5.0-6.0g/L琼脂粉，pH5.5-6.0；二倍体草莓筛选培养基S3：4.2-4.6g/L MS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.4mg/L ZT、0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、5.0-6.0g/L琼脂粉、10-30mg/L卡那霉素、300-500mg/L羧苄青霉素，pH5.5-6.0。作为优选，所述二倍体草莓种子培养基S1、二倍体草莓共培养培养基S2、二倍体草莓筛选培养基S3都进行高压灭菌，备用。6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素，可以诱导愈伤组织发生。NAA是萘乙酸，是一种有机化合物，是一种易溶于有机溶剂的无色固体，是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养。IBA为吲哚丁酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，且可以对植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂，在农业上有广泛的应用和推广价值。ZT为玉米素(Zeatin)，是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。本专利技术还提供了一种二倍体草莓的转基因培养基的转基因方法包括如下步骤：(1)菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线，25-30℃培养1-3天；所述农杆菌菌株EHA105是二倍体草莓转基因中常用菌株，侵染能力较强，该菌株购买于美国模式培养物集存库ATCC(American type culture collection)；所述质粒pK7WG2D由植物表达载体pK7WG2D携带超强表达的报告基因Egfp，使用携带强表达报告基因Egfp的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作，缩短了转基因的周期；植物表达载体pK7WG2D购买于Invitrogen生物技术公司，含基因Egfp序列在NCBI上的登录号为GenBank:KU721836.1。植物表达载体选用基于GatewayTM技术的pK7WG2D植物表达载体，GatewayTM技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，GatewayTM利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶；所述含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105的是将携带Egfp的基因表达载体pK7WG2D转化到农杆菌菌株EHA105中。挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL LB液体培养基中，25-30℃，200-250rpm在摇床中振荡培养至OD600值0.3-0.5；常温下，4000-6000rmp离心7-9分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，将上清液去除，重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定OD600值为0.1-0.3，制得活化好的菌液。(2)二倍体草莓转基因材料处理：二倍体草莓种子种植于S1培养基上，长出叶片后在无菌条件下将叶片完全剪下，用手术刀延叶脉横切；同时将草莓叶柄切成0.5-1.5厘米长段，在叶柄上面用手术刀刻伤；侵染：将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀，浸染30～40分钟；侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中23-27℃，暗培养2-4天，将叶片叶柄转入筛选培养基S3上培养18-22天，二倍体草莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，一部分没有发光。将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过约35-45天的培养以后，分化出抗性植株；此时再进行一次荧光检测，将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；抗性植株生长55-65天再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二倍体草莓的转基因培养基，其特征在于，包括如下成分：二倍体草莓种子培养基S1：2.0‑2.5g/L MS、15‑25g/L蔗糖、0.2‑0.5mg/L 6‑BA、0.0.5‑0.15mg/L NAA、5.0‑6.0g/L琼脂粉，pH5.5‑6.0；二倍体草莓共培养培养基S2：4.2‑4.6g/LMS、25‑35g/L蔗糖、0.2‑0.4mg/L ZT、0.4‑0.6mg/L TDZ、0.05‑0.15mg/L IBA,、5.0‑6.0g/L琼脂粉，pH5.5‑6.0；二倍体草莓筛选培养基S3：4.2‑4.6g/L MS、25‑35g/L蔗糖、0.2‑0.4mg/L ZT、0.4‑0.6mg/L TDZ、0.05‑0.15mg/L IBA、5.0‑6.0g/L琼脂粉、10‑30mg/L卡那霉素、300‑500mg/L羧苄青霉素、pH5.5‑6.0。

【技术特征摘要】
1.一种二倍体草莓的转基因培养基，其特征在于，包括如下成分：二倍体草莓种子培养基S1：2.0-2.5g/L MS、15-25g/L蔗糖、0.2-0.5mg/L 6-BA、0.0.5-0.15mg/L NAA、5.0-6.0g/L琼脂粉，pH5.5-6.0；二倍体草莓共培养培养基S2：4.2-4.6g/LMS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.4mg/L ZT、0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA,、5.0-6.0g/L琼脂粉，pH5.5-6.0；二倍体草莓筛选培养基S3：4.2-4.6g/L MS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.4mg/L ZT、0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、5.0-6.0g/L琼脂粉、10-30mg/L卡那霉素、300-500mg/L羧苄青霉素、pH5.5-6.0。2.根据权利要求1所述二倍体草莓的转基因培养基，其特征在于，所述二倍体草莓种子培养基S1、二倍体草莓共培养培养基S2、二倍体草莓筛选培养基S3都进行高压灭菌，备用。3.一种利用权利要求1所述二倍体草莓的转基因培养基的转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线，25-30℃培养1-3天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL LB液体培养基中，25-30℃，200-250rpm在摇床中振荡培养至OD600值0.3-0.5；常温下，4000-6000rmp离心7-9分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，将上清液去除，重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定OD600值为0.1-0.3，制得活化...

【专利技术属性】
技术研发人员：王媛花，颜志明，贾思振，蔡善亚，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32