一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法技术

本发明专利技术公开了一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV‑GFP载体，转化农杆菌后，通过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV‑GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。能够快速、高效的侵染观赏海棠组培苗植株，并能够方便进行沉默阳性植株筛选，进行基因沉默分析，改进了木本植物瞬时表达效率低等缺陷，能够应用于观赏海棠基因功能研究，为今后的观赏海棠遗传育种工作奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物功能基因组研究技术，尤其涉及一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法。
技术介绍
病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)在植物功能基因组研究中是一种方便快捷的研究工具。通常情况下，VIGS的靶标是通过构建一个重组病毒载体携带上内源基因的片段来进行沉默实验(Kumagai et al.,1995)。一旦病毒侵入到宿主植物体中，宿主体内的像转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的防御机制就会被激活，PTGS会靶标植物病毒通常产生的双链RNA，剪切双链RNA并产生siRNA。这样siRNA会组装成RNAi沉默复合体(RNAi silencing complex,RISC)来降解内源与siRNA同源的基因(Burch-Smith et al.,2004)。由于VIGS是一种瞬时作用的方法，所以它被认为是一种快速简便研究基因功能的方法，并且可以对一些突变致死基因也可以进行研究。烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV；Liu et al.,2002)是一种广泛应用的VIGS植物病毒载体并且已经成功应用于多种植物中，包括烟草叶片，拟南芥，番茄果实，矮牵牛花朵，月季花瓣和草莓。但是自从VIGS载体从植物病毒中开发出来后，VIGS的应用具有物种特异性。TRV载体更易于侵染茄科植物，例如：烟草、番茄、辣椒和矮牵牛。但是对于非茄科植物和木本植物，侵染效率就会很低，像苹果、月季。前期工作中，申请人将EGFP融合的开放阅读框融合到TRV载体的Coat Protein的3’末端，产生TRV-GFP载体。TRV-GFP载体在多种植物中进行了验证，包括：烟草、拟南芥、月季、草莓和菊花。结果表明，TRV-GFP载体侵染的植株能够被手提紫外灯检测，并且TRV-GFP载体的侵染效率与TRV原始载体相同。所以TRV-GFP载体是一个新的研究植物功能基因组学的工具，特别是对于非茄科植物。木本植物的遗传转化效率极低，且需要大量时间才能观察到表型并进行相关分析。瞬时表达是一种快速有效的分析基因功能的方式，近年来得到了广泛的应用，但是在木本植物中进行瞬时表达的方式也存在效率低，效果不稳定等缺点。因此，现有技术中，对于TRV-GFP载体能否广泛应用于苹果、海棠等木本植物尚不清楚(Tian et al.,2015)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、大量、有效并筛选方便的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，包括步骤：将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。由上述本专利技术提供的技术方案可以看出，本专利技术实施例提供的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，针对观赏海棠这一木本植物，构建基于TRV-GFP载体的基因沉默体系，该体系能够快速、高效的侵染观赏海棠组培苗植株，并能够方便进行沉默阳性植株筛选，进行基因沉默分析，改进了木本植物瞬时表达效率低等缺陷，本专利技术能够应用于观赏海棠基因功能研究，为今后的观赏海棠遗传育种工作奠定基础。附图说明图1a至图1c为本专利技术实施例中TRV-GFP载体构建示意图，其中：图1a为TRV1载体示意图；图1b为TRV2-GFP载体示意图；图1c为McRDM1基因通过酶切连接的方式插入TRV-GFP载体，生成pTRV2-GFP-McRDM1载体示意图；图2为本专利技术实施例中沉默与对照植株的半定量PCR分析结果示意图。图3本专利技术实施例中双酶切电泳图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例作进一步地详细描述。本专利技术的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，其较佳的具体实施方式是：包括步骤：将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。所述沉默目的基因片段主要为5’段编码区序列。本专利技术针对木本植物瞬时表达效率低这一缺点，通过TRV-GFP载体介导，采用真空抽吸的方式，在观赏海棠组培植株上沉默了McRDM基因，并通过荧光表型、半定量PCR等方式进行了验证。确定了基于TRV-GFP载体的VIGS系统能够通过真空抽吸的方式，快速侵染观赏海棠组培苗植株，应用于观赏海棠植株进行基因沉默分析，可以在今后的育种工作中得到进一步应用。本专利技术主要是将合适的沉默目的基因片段，主要为5’段编码区序列，通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通过调整合适的真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的快速高效观赏海棠瞬时基因沉默体系。本专利技术的有益效果：本专利技术主要是针对观赏海棠这一木本植物，构建基于TRV-GFP载体的基因沉默体系，该体系能够快速、高效的侵染观赏海棠组培苗植株，并能够方便进行沉默阳性植株筛选，进行基因沉默分析，改进了木本植物瞬时表达效率低等缺陷，本专利技术能够应用于观赏海棠基因功能研究，为今后的观赏海棠遗传育种工作奠定基础。具体实施例，如图1a至图3所示：下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1.在观赏海棠组培苗中沉默McRDM1基因：1.沉默观赏海棠RDM1基因的TRV-GFP载体的获得：以McRDM1基因编码区序列设计引物McRDM1-F、McRDM1-R,引物5’端和3’端分别加上XbaI和KpnI酶切位点，以克隆有McRDM1基因的质粒为模板进行PCR，PCR产物纯化。用XbaI和KpnI限制性内切酶(购自New England Biolabs公司)双酶切McRDM1的PCR产物和TRV2-GFP载体，反应体系和反应条件如表1。电泳后回收大片段，如图3。利用宝生物工程有限公司的T4 Vector载体将酶切后的McRDM1基因和TRV2-GFP载体连接。连接体系为TRV2-GFP载体0.3μL，McRDM1基因目的片段DNA 7.7μL，T4酶1μL，10×Buffer1μL混匀后4℃连接20h-24h。引物序列如下：McRDM1-F：McRDM1-R：表1双酶切反应体系与反应条件2.TRV-GFP-McRDM1转化观赏海棠组培苗含有TRV-GFP-McRDM1载体的农杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，其特征在于，包括步骤：将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV‑GFP载体，转化农杆菌后，通过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV‑GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。

【技术特征摘要】
1.一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，其特征在于，包括步骤：将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚允聪，田佶，宋婷婷，张杰，韩振云，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11