一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，通过载体表达靶向昆虫细胞caspase‑1的siRNA，从而实现抗细胞凋亡的杆状病毒表达载体；该杆状病毒载体上含有一段特定的DNA序列，这段DNA序列包括U6启动子及其下游21nt的靶向caspase‑1的siRNA序列；利用该载体制作的重组病毒可以在宿主细胞中表达双链小RNA，通过RNA干扰途径沉默宿主细胞编码的caspase‑1，从而抑制宿主细胞的凋亡。本发明专利技术可用于构建表达外源基因的重组杆状病毒；获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可抑制宿主细胞凋亡，使外源蛋白表达水平显著提高，从而降低生产成本。

Recombinant baculovirus vector capable of resisting host apoptosis

The invention discloses an anti host apoptosis of recombinant baculovirus, expression of targeting caspase cells 1 siRNA by the carrier, so as to realize the anti apoptotic baculovirus expression vector; contains a specific DNA sequence of the baculovirus vector, the DNA sequence including U6 promoter and its downstream 21nt the target caspase 1 siRNA sequence; the recombinant virus vector produced by the use of small double stranded RNA can be expressed in a host cell by RNA interference silencing pathways of host cells encoding caspase 1, which inhibited apoptosis of host cells. The invention can be used to construct the recombinant baculovirus expressing exogenous gene; recombinant baculovirus infected insect cells obtained after, can inhibit the apoptosis of host cells, the exogenous protein expression level increased significantly, thus reducing the production cost.

【技术实现步骤摘要】
一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体
本专利技术属于病毒载体
，尤其涉及一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体。
技术介绍
杆状病毒是特异感染节肢动物的DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)是杆状病毒的一个模式种。自从1983年Smith等首次把杆状病毒改造成为表达系统以来，由于该系统具有低成本、高产量等优点，而且表达的蛋白构象接近天然真核蛋白，杆状病毒表达系统在科研和生产中被广泛应用。杆状病毒表达系统是一种暂态表达系统，病毒感染昆虫细胞3-4天后会引起细胞的凋亡和死亡。基于晚期启动子的杆状病毒表达系统的表达时限是从感染后22-24小时开始至宿主细胞死亡。如果能推迟感染细胞的死亡时间，势必能增加外源蛋白的产量。细胞凋亡是宿主抵御病毒侵染的策略之一，其中细胞调控caspase活性对细胞凋亡非常重要。而草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中目前研究最多的caspase是执行caspase即Sf-caspase-1。2007年，台湾的一个课题组用RNA干扰载体在Sf9细胞中表达Sf-caspase-1的dsRNA，成功沉默了细胞中的Sf-caspase-1，并筛选出抑制Sf9细胞凋亡的细胞系(LinCC,HsuJTA,HuangKL,etal.Sf‐Caspase‐1‐repressedstablecells:resistancetoapoptosisandaugmentationofrecombinantproteinproduction[J].Biotechnologyandappliedbiochemistry,2007,48(1):11-19.)。因为凋亡是生物体清理衰退细胞的积极途径。如果昆虫细胞系自身的抗凋亡途径被阻断，势必会使细胞系退化。目前的抗凋亡细胞系的抗凋亡效果不具有明显的剂量效应，抗凋亡细胞系产量提高率不到2倍。目前的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞病变速度和程度不能降低，蛋白表达水平不能显著提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的问题。本专利技术是这样实现的，一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，该抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体含有一段特定的DNA序列，该DNA序列为SEQIDNO：1。进一步，该DNA序列包括U6启动子、与caspase-1同源的21nt核酸序列、9ntloop序列、与21nt核酸序列对应的21nt反义序列、作为转录终止信号的T(n)序列；所述与caspase-1同源的21nt核酸序列为SEQIDNO：2；所述9ntloop序列为SEQIDNO：3；所述与21nt核酸序列对应的21nt反义序列为SEQIDNO：4；所述作为转录终止信号的T(n)序列为SEQIDNO：5。进一步，所述U6启动子作为siRNA表达的调控序列，该U6启动子序列为SEQIDNO：6。本专利技术另一目的在于提供一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体的构建方法法为：将靶向Caspase-1小RNA的编码序列直接插入到杆状病毒基因组中；具体包括：1)、扩增U6启动子并克隆至载体质粒上；2)、设计靶向caspase-1的shRNA序列，用长引物拼接的方法获得shRNA片段；3)、将shRNA片段克隆到U6启动子下游；4)、用PCR方法扩增带U6-shRNA序列的反筛片段；5)、将反筛片段与AcMNPVBacmid共转化到含pRed/ET的大肠杆菌HS996菌株，筛选获得抗凋亡的Bacmid。本专利技术另一目的在于提供一种上述的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体制备的蛋白制品。本专利技术另一目的在于提供一种上述的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体制备的疫苗。本专利技术获得的抗凋亡Bacmid，可作为病毒载体，用于构建表达外源基因的重组杆状病毒。因为病毒载体上携带抑制昆虫细胞凋亡的干扰RNA序列，所获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞病变速度和程度降低，蛋白表达水平显著提高。经测试，以萤光素酶作为报告基因，本专利技术的抗凋亡载体比改造之前的载体萤光素酶活性提高了10倍(见图3)。本专利技术获得的杆状病毒载体可用于基础研究，也可用于大规模蛋白药物和疫苗的工业化生产。本专利技术把干扰昆虫细胞caspase-1表达的siRNA序列和调控序列克隆到杆状病毒载体骨架上，制作出了能延长感染细胞存活期的杆状病毒表达载体。本专利技术利用该载体制作的重组病毒可以在宿主细胞中表达双链小RNA，通过RNA干扰途径沉默宿主细胞编码的caspase-1，从而抑制宿主细胞的凋亡。本专利技术的杆状病毒表达载体，可用于构建表达外源基因的重组杆状病毒。所获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可抑制宿主细胞凋亡，使外源蛋白表达水平显著提高，从而降低生产成本。因为凋亡是生物体清理衰退细胞的积极途径。如果昆虫细胞系自身的抗凋亡途径被阻断，势必会使细胞系退化。本专利技术使杆状病毒载体本身具有抗凋亡特性，昆虫细胞只有在感染了重组病毒之后才阻断细胞的凋亡途径，从而避免了细胞系的退化。另外，不同于前述抗凋亡细胞系，本专利技术的抗凋亡效果具有明显的剂量效应，既每个细胞感染的杆状病毒越多，转录的小RNA越多，抗凋亡效果越好。基于这个原因，用本专利技术的载体表达外源蛋白可以使产量提高10倍左右，而前述抗凋亡细胞系产量提高不到2倍。本专利技术在真核来源的蛋白表达中有很好的应用前景，可用于蛋白制品和疫苗的生产。附图说明图1本专利技术提供的重组杆状病毒载体的构建方法示意图。图2使用本专利技术提供的重组杆状病毒载体制备的表达萤光素酶的Westernblot检测结果。图3使用本专利技术提供的重组杆状病毒载体制备的表达萤光素酶的酶活检测结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本专利技术实施例提供的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，该抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体含有一段特定的DNA序列，该DNA序列为SEQIDNO：1。GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAGTACTGCAGGCTAGGATGCCAGTTGATAGAGCTTATTAATCTATCAACTGGCATCCTAGCTTTTTT。进一步，该DNA序列包括U6启动子、与caspase-1同源的21nt核酸序列、9ntloop序列、与21nt核酸序列对应的21nt反义序列、作为转录终止信号的T(n)序列；所述与caspase-1同源的21nt核酸序列为SEQIDNO：2；GCTAGGATGCCAGTTGATAGA。所述9ntloop序列为SEQIDNO：3；GCTTATTAA。所述与2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，其特征在于，该抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体含有一段特定的DNA序列，该DNA序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，其特征在于，该抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体含有一段特定的DNA序列，该DNA序列为SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，其特征在于，该DNA序列包括U6启动子、与caspase-1同源的21nt核酸序列、9ntloop序列、与21nt核酸序列对应的21nt反义序列、作为转录终止信号的T(n)序列；所述与caspase-1同源的21nt核酸序列为SEQIDNO：2；所述9ntloop序列为SEQIDNO：3；所述与21nt核酸序列对应的21nt反义序列为SEQIDNO：4；所述作为转录终止信号的T(n)序列为SEQIDNO：5。3.如权利要求2所述的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述U6启动子作为siRNA表达的调控序列，该U6启动子序列为SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓东，陈红英，欧艳梅，徐可言，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61