一种CD20抗体免疫磁珠及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种CD20抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示CD20抗体，或者A表示CD20抗体，B表示磁性微球。将本发明专利技术的免疫磁珠用于捕获肿瘤细胞，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。而且免疫磁珠的性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。并且制备方法简单，具有很强的实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种CD20抗体免疫磁珠及其制备方法。
技术介绍
CD20分子是B淋巴细胞上的跨膜蛋白质，由297个氨基酸组成，属于非糖基化磷蛋白，是B淋巴细胞表面分化抗原，主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统中起重要作用，常被用作鉴定B细胞的标记。CD20是B淋巴细胞表面的特异性标志分子，它高表达于多数B淋巴细胞表面，在95％以上的正常或恶性B淋巴细胞中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达，并且不会发生明显的内化和脱落，是B淋巴细胞理想的生物免疫标志物。免疫磁珠分选法(Immunomagneticseparation，IMS)是近年来兴起的一种用于细胞分选的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原-抗体反应，在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会定向移动，使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当具超顺磁性的磁珠脱离磁场后，磁性立即消失，从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。将免疫磁珠分选法应用于细胞的分选是本领域近年来兴起的技术。但是利用免疫磁珠分选法从血液复杂的环境中分选出特定的细胞，需要免疫磁珠具有特异性的生物标志物，而且稳定性、分散性好，不能团聚。同时，免疫磁珠的粒径不能过大，过大会压迫细胞；免疫磁珠的粒径也不能过小，粒径过小磁响应性也小，容易无法达到细胞分选的效果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种CD20抗体免疫磁珠及其制备方法，本专利技术的CD20抗体免疫磁珠粒径小，磁响应性好，用于B淋巴细胞捕获，捕获效率高，富集时间短，捕获得到的B淋巴细胞可以进行进一步的分析，同时制备过程简单，成本低。在本专利技术的一方面，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种CD20抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示CD20抗体，或者A表示CD20抗体，B表示磁性微球。优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球部分为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。优选的，所述CD20抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。在本专利技术的第二方面，提供了一种制备上述CD20抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：s1.磁性纳米簇的制备；s2.氨基修饰的磁性微球的制备；s3.肼基修饰的A部分的制备；s4.醛基修饰的B部分的制备；s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。在本专利技术的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰，并且对CD20抗体进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对CD20抗体进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或CD20抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。最优选的，SANH的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或CD20抗体的25倍。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或CD20抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本专利技术一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对CD20抗体的修饰反应时间2～4h。进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或CD20抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。最优选的，SFB的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或CD20抗体的10倍。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或CD20抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本专利技术一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对CD20抗体的修饰反应时间2～4h。所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本专利技术的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和稳定性即可。优选的，本专利技术采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时，可以对反应原料的比例进行调整，均不超出本专利技术的保护范围。优选的，所述步骤s5中，磁性微球和CD20抗体的质量比为1：(0.01～1)。CD20抗体与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联CD20抗体，但是考虑到CD20抗体的成本因素，本专利技术采用磁性微球和CD20抗体的质量比为1：(0.01～0.2)。在本专利技术的第三方面，提供了一种用于捕获B细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的CD20抗体免疫磁珠。本专利技术的有益效果为：(1)将本专利技术的免疫磁珠用于捕获B细胞，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。避免了捕获的B细胞损伤，B细胞可以用于进一步的分析和培养。(2)本专利技术的免疫磁珠，其磁性微球部分和CD20抗体部分通过腙键结构相连，得到的免疫磁珠在弱碱性条件下(血液中)性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。(3)本专利技术的制备方法简单，反应条件温和，氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行，不容易造成CD20抗体的变质、降解等，同时避免了使用还原剂，使CD20抗体可以在低温下与细胞孵育，保持CD20抗体和细胞的生物活性。(4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD20抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示CD20抗体，或者A表示CD20抗体，B表示磁性微球。

【技术特征摘要】
1.一种CD20抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示CD20抗体，或者A表示CD20抗体，B表示磁性微球。2.根据权利要求1所述的CD20抗体免疫磁珠，其特征在于：所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。3.根据权利要求1所述的CD20抗体免疫磁珠，其特征在于：所述CD20抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。4.一种制备权利要求1-3中任一项所述CD20抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：s1.磁性纳米簇的制备；s2.氨基修饰的磁性微球的制备；s3.肼基修饰的A部分的制备；s4.醛基修饰的B部分的制备；s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。5.根据权利要求4所述CD20抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或CD20抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。6.根据权利要求4所述CD20抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中的醛基修饰的B...

【专利技术属性】
技术研发人员：李静，蔡红东，陈昌岳，刘关，张培培，张祥林，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31