一种提取植物DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取植物DNA的方法。所述方法包括：将研磨后的植物组织样品与裂解缓冲液混合，加热孵育，离心获取上清液，将所述上清液与沉淀液混合低温处理，再次离心获取最终上清液，进行分离纯化处理，得到DNA，所述裂解缓冲液含有：醋酸盐、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠。本发明专利技术的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求，该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高，此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点，适合大规模的推广和应用。和应用。和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种提取植物DNA的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种提取植物DNA的方法。

技术介绍

[0002]近年来Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies、Bionano Genomics和10x Genomics等公司的长读长测序技术越来越受欢迎，随着相关技术的推广应用，而获得大片段、高纯度、高含量和高完整性的基因组DNA显得尤为重要。高质量DNA分子(high
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molecular
‑
weight DNA)是指片段长度在200bp
‑
1Mb之间，目前已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。
[0003]传统DNA提取方法获得的DNA片段长度在50kb左右，很少有大片段DNA，而以NanoPore、PacBio为代表的三代测序平台具有长读长的优点，三代测序技术对DNA质量要求较高，即：OD260/280比值范围在1.7
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2.0，OD260/230比值范围在1.6
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2.0；Nanodrop/Qubit比值范围在1.5以下；浓度大于等于10ng/μL；DNA总量大于等于5μg。传统的DNA提取方法产生的DNA片段长度、纯度及完整性较难满足测序平台要求，因此需要获得高质量DNA。
[0004]植物DNA提取多采用的是新鲜或冷冻状态保存的组织，但是涉及到野外采集特别是距离较远的山林采集样本时就受到液氮或冰壶携带不方便，这时候硅胶干燥样本便于携带的优势就较为凸显。目前常用的DNA提取方法有CTAB法、SDS法和试剂盒法，均可以适用于新鲜或冷冻样本核酸提取，但是提取时间较长，都要使用有毒有机物进行提取，比如氯仿、苯酚、异戊醇被用于去除蛋白质和多糖杂质，β
‑
巯基乙醇多用于防止酚类物质氧化，其中氯仿和β
‑
巯基乙醇易挥发，进入人体后易引起中毒，这些有机物质不仅会对人体产生伤害，而且对环境造成危害。植物干燥样本产生的次级代谢物质常与核酸形成复合物，DNA被包裹在这些粘稠的胶状物质中难以溶解分离出来，并且会产生不同成都的褐变，导致抽提结果较差，因此急需寻找解决方法。
[0005]CN105505916A公开了从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法及试剂盒，所述方法包括对干燥叶片细胞研磨破碎，两步法抽提DNA、杂质的去除以及DNA的纯化，所述方法能够有效的去除干燥组织样本中富含的多酚、多糖等次生代谢产物，最终获得高质量的基因组DNA，但是所述方法需要使用氯仿、苯酚和异戊醇等有机物质，进入人体后易引起中毒，不仅会对人体产生伤害，而且对环境造成危害。
[0006]CN109652403A公开了一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，所述方法包括干燥叶片研磨、去糖、裂解、抽提、沉淀、洗涤和检测等步骤。其中，去糖是此专利技术的关键，在核膜没有裂解释放出基因组DNA之前，加入预热的去糖缓冲液，在65℃水浴条件下悬浮叶片组织溶液，可以使多糖及其他次生代谢物质溶解于缓冲液中，再通过低速离心去除多糖等杂质，使最后沉淀得到DNA的具有较高的浓度和纯度。但是此方法得到的DNA片段大小集中于40K～60K之间，难以满足测序平台的要求。
[0007]综上所述，目前提取植物干燥叶片DNA的方法存在使用氯仿、苯酚和异戊醇有毒有机物，危害人体和环境，DNA片段长度在50kb左右，很少有大片段DNA，难以得到高质量DNA，
难以满足测序平台需要等问题。如何提供一种高效便捷的提取植物干燥叶片DNA的方法，获得高效率、高质量和高纯度的DNA，满足三代测序平台对DNA质量的要求，已成为目前分子生物学
亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种提取植物DNA的方法，解决了目前提取植物DNA的方法使用有毒有机试剂、难以获得高质量DNA等问题，达到了高效率获得高质量和高纯度的DNA，满足三代测序平台对DNA质量的要求的效果。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种提取植物DNA的方法，所述方法包括：
[0011]将研磨后的植物组织样品与裂解缓冲液混合，加热孵育，离心获取上清液，将所述上清液与沉淀液混合并进行低温处理，再次离心获取最终上清液，进行分离纯化处理，得到DNA，所述裂解缓冲液含有：醋酸盐、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，所述沉淀液含有醋酸盐。
[0012]本专利技术提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求，该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高，此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点，适合大规模的推广和应用。
[0013]优选地，所述分离纯化处理具体包括：
[0014]向最终上清液中加入异丙醇和羟基磁珠溶液进行核酸吸附，用漂洗液漂洗磁珠，用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液，向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化，收集磁珠，用漂洗液漂洗磁珠，用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA溶液。
[0015]优选地，所述植物组织样品包括干燥叶片。
[0016]优选地，所述研磨在液氮环境中进行。
[0017]优选地，所述裂解缓冲液的pH为4.0
‑
6.5。
[0018]上述4.0
‑
6.5中的具体点值可以选择4.0、4.5、5、5.5、6、6.5等。
[0019]优选地，所述裂解缓冲液中所述醋酸盐的浓度为20
‑
200mM。
[0020]上述20
‑
200中的具体点值可以选择20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、160、180、200等。
[0021]优选地，所述裂解缓冲液中所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为20
‑
300mM。
[0022]上述20
‑
300中的具体点值可以选择20、25、30、65、80、100、150、160、270、280、290、300等。
[0023]优选地，所述裂解缓冲液中所述十二烷基硫酸钠质量百分比为0.5
‑
5％。
[0024]上述0.5
‑
5中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3、4、5等。
[0025]优选地，所述裂解缓冲液中所述聚乙烯吡咯烷酮质量体积百分比为0.5
‑
5％。
[0026]上述0.5
‑
5中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3、4、5等。
[0027]优选地，所述裂解缓冲液中所述氯化钠的浓度为200
‑
1500mM。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取植物DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：将研磨后的植物组织样品与裂解缓冲液混合，加热孵育，离心获取上清液，将所述上清液与沉淀液混合并进行低温处理，再次离心获取最终上清液，进行分离纯化处理，得到DNA；所述裂解缓冲液含有：醋酸盐、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，所述沉淀液含有醋酸盐。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化处理具体包括：向最终上清液中加入异丙醇和羟基磁珠溶液进行核酸吸附，用漂洗液漂洗磁珠，用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液；向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化，收集磁珠，用漂洗液漂洗磁珠，用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA溶液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述研磨在液氮环境中进行。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的pH为4.0
‑
6.5；优选地，所述裂解缓冲液中所述醋酸盐的浓度为20
‑
200mM；优选地，所述裂解缓冲液中所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为20
‑
300mM；优选地，所述裂解缓冲液中所述十二烷基硫酸钠质量百分比为0.5
‑
5％；优选地，所述裂解缓冲液中所述聚乙烯吡咯烷酮质量体积百分比为0.5
‑
5％；优选地，所述裂解缓冲液中所述氯化钠的浓度为200
‑
1500mM；优选地，所述裂解缓冲液中所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵中任意一种；优选地，所述裂解缓冲液中所述聚乙烯吡咯烷酮包括PVPK30、PVPK10或PVP40中任意一种；优选地，所述沉淀液中醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵中任意一种。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物组织样品与裂解缓冲液的质量体积比为1g:(3
‑
10)mL。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其特征在于，所述低温处理包括：3
‑
10℃条件下放置5
‑
3...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁婷婷，董亚晨，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：