本发明专利技术公开了CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，属于抗体偶联药物领域。其特征在于：长春新碱和CD33抗体多肽的偶联结合物；所述CD33抗体多肽为全新序列。所述的CD33抗体多肽采用化学合成法制备。所述的长春新碱‑半琥珀酸酯与CD33抗体多肽偶联采用碳化二亚胺化。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。有益效果在于促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是抗体偶联药物领域。具体来说，本专利技术涉及CD33抗体多肽偶联抗肿瘤药长春新碱的结合物。
技术介绍
长春新碱(Vincristine，Oncovin，VCR)是夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，因抗肿瘤作用良好，目前其制剂作为临床抗肿瘤药物。临床用于急性白血病，尤其是儿童急性白血病，对急性淋巴细胞白血病疗效显著。恶性淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌，尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病、消化道癌、黑色素瘤及多发性骨髓瘤等。尽管长春新碱被广泛的应用于癌症的化疗方案，但由于化疗存在着比较严重的骨髓抑制，肠胃道反应和肝肾损伤等。现在研究进展往长春新碱脂质体方向，用来降低长春新碱的神经毒性。脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。但是，脂质体剂型本身存在不稳定性，因此，始终未用于临床。抗肿瘤抗体通过化学修饰与效应分子偶联，这些偶联物既有特异性识别肿瘤抗原的能力，也保留了效应分子杀伤肿瘤细胞的毒性，注射于肿瘤患者体内，可定向地浓聚到肿瘤部位，选择性杀伤肿瘤细胞。因此，专利技术人希望能够将长春新碱与特异性的抗体偶联，从而产生肿瘤细胞的靶向作用，提高疗效，减少毒副作用。CD33是髓系细胞分化抗原，分子量为67KD，主要分布在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段。CD33在90％以上的急性髓系白血病患者都有表达。在造血干细胞表面没有表达，在成熟的粒细胞和其他组织也没有表达，因此CD33成为髓系白血病治疗的良好靶点。目前已经有肿瘤的临床试验测试对抗CD33受体的抗体。CD33抗体可以靶向作用于肿瘤细胞表面，且本身具有抗肿瘤的作用。目前常用的抗体仍以鼠源单抗为多，且分子量较大，具有较强的免疫原性，长期用于人体会产生免疫反应，导致自身免疫疾病。因此，本专利技术提供了一种特异性强，纯度较高的小分子CD33抗体多肽与长春新碱偶联的结合物，促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种特异性强，纯度较高的小分子CD33抗体多肽与长春新碱偶联的结合物，促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。技术方案本专利技术的技术方案在于提供一种小分子CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，其特征在于：(1)用长春新碱、琥珀酸酐和三乙基胺用100ml乙酰乙酯溶解，加热回流1小时；(2)蒸馏去溶剂，残余物用5％NaHCO3水溶液溶解；(3)乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行酸化，至pH2.0；(4)用氯仿-已烷结晶，得固形物；(5)取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯，65℃，加热30分钟，减压蒸发，干燥1小时；(6)将上述产物溶于15mlN，N-二甲基-乙酸乙酰胺中，室温搅拌反应2小时；(7)65℃，真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来，得长春新碱-半琥珀酸酯；(8)长春新碱-半琥珀酸酯与CD33抗体多肽偶联，即得。所述的CD33抗体多肽采用化学合成法制备。所述的长春新碱-半琥珀酸酯与CD33抗体多肽偶联采用碳化二亚胺化。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。优选为在制备用于治疗乳腺癌药物中的应用。有益效果本专利技术的小分子CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，可用于促进长春新碱的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高长春新碱在体内肿瘤组织的浓度；同时降低长春新碱在全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑等组织的分布；(2)显著性抑制肿瘤细胞的增殖；(3)降低长春新碱的毒性；(4)CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物能与肿瘤细胞的特异性结合；(5)在荷瘤小鼠体内，提高生存率。具体实施方式多肽由上海生工吉尔合成。实施例1制备CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物：用长春新碱、琥珀酸酐和三乙基胺用100ml乙酰乙酯溶解，加热回流1小时；蒸馏去溶剂，残余物用5％NaHCO3水溶液溶解；乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行酸化，至pH2.0；用氯仿-已烷结晶，得固形物；取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯，65℃，加热30分钟，减压蒸发，干燥1小时；将上述产物溶于15mlN，N-二甲基-乙酸乙酰胺中，室温搅拌反应2小时；65℃，真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来，得长春新碱-半琥珀酸酯；长春新碱-半琥珀酸酯与CD33抗体多肽采用碳化二亚胺化偶联，冻干，即得。实施例2用人乳腺癌移植瘤模型检测CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物的体内活力。6-8w龄SCID雌性小鼠，小鼠随机分成5组，每组10只。(1)空白组；(2)结合物低剂量组；(3)结合物中剂量组；(4)结合物高剂量组；(5)长春新碱阳性组。建立人乳腺癌移植瘤模型，在接种乳腺癌细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为结合物设3个剂量：0.125、0.25、0.5μmol/Kg，阳性组为0.5μmol/Kg的长春新碱，每天给药，连续14天。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，结合物可有效地保护荷瘤小鼠，在剂量0.125、0.25、0.5μmol/Kg时可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为57.3，75.2，89.0％。实施例3乳腺癌细胞的体外增殖率实验：采用MTT比色法。将对数生长的人乳腺癌细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h；实验分为5组，分别为空白组、阳性组和低中高剂量的实施例1得到的CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物；分别加入相同体积的DMEM培养基(HyClone，含胎牛血清20％)，长春新碱(1mmol/ml)和CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物(12.5、25、50μmol/ml)。每孔设五个复孔，培养48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成乳腺癌细胞抑制率＝(1—实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。长春新碱阳性组和实施例1的偶联结合物低中高剂量实验组的乳腺癌细胞的抑制率分别为54.9±13.6、89.1±23.9、144.7±37.1％(p＜0.05)。实施例4用人乳腺癌移植瘤模型检测CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物的体内分布。6-8w龄SCID雌性小鼠，小鼠随机分成3组，每组6只。(1)空白组；(2)结合物组；(3)长春新碱阳性组。建立人乳腺癌移植瘤模型，在接种乳腺癌细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为2mmol/Kg剂量的结合物，阳性组为2mmol/Kg的长春新碱，每天给药，连续7天。14天后，将小鼠处死后，分别取全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤等组织。全血肝素抗凝，将肝素抗凝血离心沉淀血细胞，取上清血浆0.5ml，加入2.67％HCLO4，离心沉淀血浆蛋白，上清水浴加热100℃20分钟，待测；各组织经过匀浆、除蛋白、离心后，取上清。采用HPLC法检测血浆及组织的上清中长春新碱的含量。提取方法：在血浆及组织的上清中加入5ml二氯甲烷，充分混匀、萃取，离心，取上清，将有机溶剂挥去，再以200μl流动相溶解。色谱条件：C18色谱柱(15cm，5μm*4.6mm)，流动相：0.04磷酸缓冲液-甲醇(4.5：5.5，pH3.0)，流速：1ml/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小分子CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，其特征在于：长春新碱和CD33抗体多肽的偶联结合物；所述CD33抗体多肽的序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种小分子CD33抗体多肽与长春新碱的偶联结合物，其特征在于：长春新碱和CD33抗体多肽的偶联结合物；所述CD33抗体多肽的序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述偶联结合物的制备，其特征在于：步骤包括：（1）用所述长春新碱、琥珀酸酐和三乙基胺用100ml乙酰乙酯溶解，加热回流1小时；（2）蒸馏去溶剂，残余物用5%NaHCO3水溶液溶解；（3）乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行酸化，至pH2.0-3.0；（4）用氯仿-已烷结晶，得固形物；（5）取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯，65℃，加热30分钟，减压蒸发，干燥1小时；（6）将上述产...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗瑞雪，
申请(专利权)人：苏州普罗达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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