具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及其制备方法技术

本发明专利技术所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成。本发明专利技术还提供了上述脂质体的制备方法。该脂质体兼具主动瘤靶向性、ATP敏感的荧光发射和药物释放开关和体内长循环功能，实现将肿瘤近红外荧光显像肿瘤诊断和肿瘤治疗结合在同一脂质体上，且制备工艺简单易操作。

【技术实现步骤摘要】
具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及其制备方法
本专利技术属于肿瘤诊断与治疗领域，具体涉及一种具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及其制备方法。
技术介绍
肿瘤已经成为威胁人类健康的重大疾病。目前肿瘤确诊时，绝大多数肿瘤患者处于中晚期，治疗方法主要以手术、放疗、化疗为主。而肿瘤中晚期患者治疗后极易出现复发、耐药、转移以及并发症，这是治疗失败和病人死亡的主要原因。近年来发展起来的“纳米诊治系统”将诊断和治疗整合于同一纳米探针上，同时实现肿瘤的高灵敏度检测与微创/无创治疗，操作简便、成像灵敏度更高、诊断和治疗同时进行，为癌症的早诊早治提供了新的思路和手段。荧光示踪技术是指将能发荧光的物质导入所要跟踪或显影的细胞或组织中，利用荧光特性提供被研究对象的信息。化疗是一种传统的肿瘤治疗方法，利用细胞毒性物质能有效抑制细胞生长。化疗药物没有细胞选择性、对正常组织存在严重的毒副作用，且容易使肿瘤细胞产生耐药性，造成治疗失败。因此，将荧光成像技术与化学药物治疗加以整合，并辅以靶向和“智能”荧光开关与可控药物释放将更有利于临床对癌症的早期检出率和治疗率的提高。现有技术报道了一种ATP介导的脂质体药物传递系统，该系统由两部分组成：一是内容物为负载阿霉素的ATP敏感寡核酸双链的脂质体，其外层脂质体成分为卵磷脂、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和精氨酸6组氨酸4-烷烃18(精氨酸6组氨酸4为细胞穿膜肽)；二是内容物为ATP的脂质体，其外层脂质体成分为卵磷脂、DOTAP(一种阳离子类脂)和胆固醇。该脂质体药物传递系统可以将阿霉素高效递送到细胞内，脂质体与细胞膜融合，释放的ATP触发ATP敏感寡核苷酸双链解开，释放出阿霉素，从而发挥抗癌作用(EnhancedAnticancerEfficacybyATP-MediatedLiposomalDrugDelivery，RanMo等，Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,5815–5820)。但该脂质体药物传递系统只具有肿瘤治疗功能，而无荧光成像功能，无法实时监测药物释放和肿瘤治疗效果。此外，该脂质体药物传递系统虽可利用增强渗透与滞留效应(EPR效应)进入肿瘤组织，具有一定的肿瘤物理靶向性，但无主动肿瘤靶向性，所以靶向效率较低，导致部分药物分布在非肿瘤组织，造成毒副作用。现有技术中还报道了一种三磷酸腺苷(ATP)触发荧光开关的胶束，可作为荧光探针用于活细胞分子影像。该胶束的分子结构为5’-Lipid-(PEG)2-Dabycl(荧光淬灭剂)-GACCTGGGGGAGTATTGCGGAAGGTT-(PEG)6-CCAGGTC-TMR(荧光分子)-3’，在细胞外低浓度ATP环境中呈环状，此时荧光分子和荧光猝灭剂距离很近，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，荧光被淬灭，处于关闭状态；在细胞内高浓度ATP环境中，胶束分子构型变化，环状解开，荧光分子和荧光淬灭剂距离增大，使荧光复原，荧光信号开启，实现荧光显像(CuichenWuetal.ACSNANO,2013,7:5724-5731)。该胶束作为荧光探针可在体内有效传递，进入细胞，并具有高信号-低背景比值，优良的选择性和生物相容性，但存在以下问题：1、仅依靠纳米尺寸的增强渗透和滞留(EPR)效应达到肿瘤部位，无主动靶向性，靶向效率差，文章没有提供体内靶向实验数据；2、PEG链太短，难以实现延长体内循环的效果；3、需要合成含寡核苷酸、聚乙二醇和二脂肪酰基脂质的杂化分子，合成步骤多，合成难度大，纯化操作复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及其制备方法，该脂质体兼具主动瘤靶向性、ATP敏感的荧光发射和药物释放开关和体内长循环功能，实现将肿瘤近红外荧光显像肿瘤诊断和肿瘤治疗结合在同一脂质体上，且制备工艺简单易操作。本专利技术所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述ATP敏感荧光探针脂质体为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成，肿肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇的摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链为偶联荧光染料cy3、cy5、cy5.5、cy7中的一种的ATP敏感核苷酸单链。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述ATP敏感核苷酸单链的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链为偶联荧光淬灭剂4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互补单链。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为末端氨基酸为半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环状多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的人类表皮生长因子受体2多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的转铁蛋白偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺中的一种。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为肿瘤靶向多肽偶联的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。本专利技术所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体的制备方法，工艺步骤如下：(1)将末端为半胱氨酸的肿瘤靶向多肽与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇的用量以所述混合溶液中磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的摩尔浓度为1～10mmol/L计，将所得混合溶液在室温下搅拌20～28小时进行反应，反应结束后除去反应液中的溶剂，即得肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺；(2)将步骤(1)制备所得肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇按摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)溶于氯仿和甲醇复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和磷脂总浓度为1～10mmol/L计，减压蒸馏除去混合溶液中的溶剂得到偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜；(3)将偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链按摩尔比1:1加入去离子水得混本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述ATP敏感荧光探针脂质体为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成，肿肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇的摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)。

【技术特征摘要】
1.具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述ATP敏感脂质体为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成，肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇的摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)。2.根据权利要求1所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链为偶联荧光染料cy3、cy5、cy5.5、cy7中的一种的ATP敏感核苷酸单链。3.根据权利要求2所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述ATP敏感核苷酸单链的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链为偶联荧光淬灭剂4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互补单链。5.根据权利要求1至3中任一权利要求所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为末端氨基酸为半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环状多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的人类表皮生长因子受体2多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的转铁蛋白偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺中的一种。6.根据权利要求5所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为肿瘤靶向多肽偶联的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种。7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。8.根据权利要求4所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。9.一种具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：(1)将末端为半胱氨酸的肿瘤靶向多肽与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺按摩尔比1:1溶于甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莉，林艺，顾忠伟，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51